Общая микробиология. Лабораторный практикум

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Х.М. БЕРБЕКОВА»

З.Ф. Хараева, Л.З. Блиева, Е.Б. Барокова

ОБЩАЯ

МИКРОБИОЛОГИЯ

Лабораторный практикум

Рекомендовано Редакционно-издательским советом КБГУ в качестве учебного пособия для обучающихся

по специальности 32.05.01 Медико-профилактическое дело

Нальчик

КБГУ

2024

УДК 576.8 (075) ББК 28.4 я73 Х20

Рецензенты:

кафедра микробиологии и биологии медицинского института Чеченского государственного университета

доктор биологических наук, профессор кафедры зоотехники

иветеринарно-санитарной экспертизы Кабардино-Балкарского государственного аграрного университета им. В.М. Кокова

Ф.М. Хасаева

Авторы: Хараева З.Ф., Блиева Л.З., Барокова Е.Б.

Х20 Общая микробиология : лабораторный практикум / З. Ф. Хараева, Л. З. Блиева, Е. Б. Барокова ; Министерство науки и высшего образования Российской Федерации, Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова. – Нальчик : Каб.-

Балк. ун-т, 2024. – 66 с. : ил. – Библиогр. : с. 65. – 100 экз. – Текст :

непосредственный.

Издание содержит краткое изложение тем лабораторных работ по разделам общей микробиологии, задания и контрольные вопросы.

Предназначено для самостоятельной подготовки к лабораторным занятиям по общей микробиологии обучающихся специальности «Медикопрофилактическоедело».

.

УДК 576.8 (075) ББК 28.4 я73

♥ Хараева З.Ф., Блиева Л.З., Барокова Е.Б., 2024

2

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ …………………………………………………………. 5

РАЗДЕЛ I. МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ……………. 6 ТЕМА 1.1. Микробиологические лаборатории и их оборудование.

клеточных форм микроорганизмов ………………………………... 22 РАЗДЕЛ II.ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ……………... 27 ТЕМА 2.1. Бактериологический метод. Культивирование микроорганизмов: питательные среды и методы стерилизации. Выделе-

ние чистых культур ………………………………………………… 27

ТЕМА 2.2. Бактериологический метод: техники пересева чистой культуры …………………………………………………………….. 32

ТЕМА 2.3.Бактериологический метод: изучениебиохимических свойств бактерий………………………………………………………. 35

ТЕМА 2.4.Бактериологический метод: изучениебиохимических свойств бактерий (окончание).Действие внешних факторов на микроорганизмы, антибиотики…………………………………………… 37 ТЕМА 2.5.Экологиямикроорганизмов:распространение микробов

3

РАЗДЕЛ V. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 57 ТЕМА 5.1. Санитарно-микробиологическое исследование оборудования, рук и спецодежды персонала …………………………. 57 ТЕМА 5.2. Исследование на носительство золотистого стафило-

кокка …………………………………………………………………. 59

РАЗДЕЛ VI. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ …………………………… 61 ТЕМА 6.1. Микрофлора пищевых продуктов …………………….. 61

ЛИТЕРАТУРА ……………………………………………………… 65

4

ВВЕДЕНИЕ

Микробиология – базовая дисциплина, знание которой необходимо каждому медицинскому работнику, так как эта наука способствует решению важных проблем клинической, медико-профилактической и фундаментальной медицины. Лабораторный практикум «Общая микробиология» разработан для проведения лабораторных занятий по дисциплине «Общая микробиология» у студентов 1 курса специальности «Медико-профилактическое дело» (Санитарный врач).

На занятиях по микробиологии студенты знакомятся с основными свойствами микроорганизмов, особенностями морфологии, культуральными свойствами, генетическими основами изменчивости и факторами патогенности различных микроорганизмов. На лабораторных занятиях по дисциплине «Общая микробиология» студенты осваивают основные методы микробиологической диагностики, приобретают навыки работы с возможными возбудителями инфекционных заболеваний, что наиболее актуально для будущих выпускников по направлению подготовки «Медико-профилактическое дело».

Каждая тема соответствует одному занятию и включает теоретический и практический блоки, а также вопросы для самоподготовки. Материал лабораторного практикума соответствует утвержденной рабочей программе по дисциплине «Общая микробиология». Теоретический блок содержит информацию, необходимую для освоения данной темы, практический блок состоит из описания лабораторных работ с подробным изложением методик окраски препаратов, методов культивирования бактерий на искусственных питательных средах, определения биохимических свойств, антигенных свойств.

Предыдущие выпуски лабораторных практикумов по общей микробиологии для студентов специальности «Лечебное дело», подготовленные преподавателями кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВО «Кабардино-Балкарский государственный университет» во главе с профессором Габриловичем И.М., способствовали осуществлению данного издания.

5

РАЗДЕЛ I МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

ТЕМА 1.1. Микробиологические лаборатории и их оборудование. Микроскопический метод исследования: нативные препараты

Лабораторные занятия по микробиологии, вирусологии начинаются с ознакомления студентов с организацией микробиологической лаборатории, её оборудованием, основными методами исследования.

В микробиологических лабораториях выполняется бактериологические, вирусологические, микологические, иммунологические и молеку- лярно-генетические анализы материалов, полученных от больных с целью диагностики заболеваний, обследуются бактерионосители и проводятся санитарно-микробиологические исследования госпитальных учреждений, воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов. Микробиологические лаборатории создаются при лечебных, учебных и научных учреждениях, санитарно-эпидемиологических станциях (СЭС).

Работа с болезнетворными микробами требует обязательного соблюдения ряда правил личной профилактики.

Правила работы в микробиологических лабораториях

1.Работа в лаборатории должна проводиться в сменной обуви,

вмедицинских халатах и шапочках. В необходимых случаях на лицо надевается маска. При работе с особо опасными микроорганизмами необходимо руководствоваться специальными инструкциями.

2.В лаборатории не разрешается курить и принимать пищу, а также делать лишние передвижения.

3.Рабочее место должно быть в образцовом порядке, личные вещи следует хранить в специально отведенных местах. Из личных вещей студента на рабочем столе допускается иметь только рабочую тетрадь,

вкоторой делаются записи и зарисовки.

4.При случайном попадании заразного материала на стол или на пол это место тщательно обрабатывается дезинфицирующим раствором.

5.После окончания работы нужно тщательно вымыть руки и при необходимости обработать их дезинфицирующим раствором.

6.Хранение и уничтожение микроорганизмов проводится согласно специальным инструкциям.

6

Методы микробиологических исследований

Все микробиологические исследования могут быть сведены к 5 основным методам:

–микроскопический метод состоит в изучении исследуемого материала с помощью различных микроскопов;

–бактериологический (микологический, вирусологический) метод

заключается в искусственном культивировании микроорганизмов и выделении чистых культур с последующей их идентификацией (определением вида);

– иммунологический метод основан на определении специфических антител к антигенам в крови и других биологических жидкостях пораженного организма с помощью различных реакций иммунитета;

– биологический или экспериментальный метод заключается в заражении животных исследуемым материалом с целью воспроизведения инфекционного заболевания или последующего выделения возбудителя;

– аллергический метод заключается в постановке кожных аллергических проб с соответствующими аллергенами с целью обнаружения повышенной чувствительности макроорганизма к определенным возбудителям инфекционных заболеваний или продуктам их жизнедеятельности.

Микроскопический метод исследования

Изучение морфологии микроорганизмов ввиду их малой величины возможно только с помощью микроскопа. Для микробиологических исследований используют несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный) и специальные методы микроскопии.

Современные световые микроскопы характеризуются предельной разрешающей способностью 0,2 мкм, под которой понимают наименьшее расстояние между двумя точками, различимое с помощью микроскопа. Разрешающая способность микроскопа (d) описывается формулой d = λ/NA, где λ – длина волны проходящего света, NА – численная (нумерическая) апертура объектива, равная n sinσ (n – показатель преломления среды между объектом и объективом, а σ – половина отверстного угла, образуемого двумя крайними лучами, попадающими в объектив). Для иммерсионных объективов NA = 1,25, для объективов сильного увеличения – 0,65, для объективов слабого увеличения – 0,2.

7

Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. В повседневной практике обычно используют увеличение порядка 630–900.

Основныеразновидностиметодовсветовоймикроскопии

Микроскопия в темном поле. Ее применяют для изучения неокрашенных микробов, их подвижности. Этот метод микроскопии требует специального конденсора с затемненной центральной частью, которая, задерживая центральную часть пучка лучей, пропускает лишь боковые косо направленные лучи. В связи с этим поле зрения остается неосвещенным, в то время как объекты, находящиеся в препарате, ярко светятся на темном фоне.

Люминесцентная микроскопия. Люминесценция – это свечение объекта, возбуждаемое поглощенной световой энергией (коротковолновая и ультрафиолетовая части спектра). Микробы обладают слабой собственной первичной люминесценцией, и поэтому на практике пользуются наведенной люминесценцией путем обработки объекта растворами; люминесцирующих красителей – флюорохромами, которые светятся под влиянием ультрафиолетовых и коротковолновых синих лучей. Отдельные флюорохромы обладают избирательностью, то есть связываются с отдельными клеточными структурами (ядро, цитоплазма, включения). Для люминесцентной микроскопии необходим источник ультрафиолетового света и набор светофильтров.

Фазово-контрастная микроскопия. Изучение живых неокрашен-

ных микробов затруднено в связи с их малой контрастностью. В видимом свете они прозрачны. Однако при прохождении света через микробную клетку происходит изменение фазы световых лучей, что обусловлено различиями толщины и показателей преломления отдельных структур. Эти изменения могут быть обнаружены при использовании специальных фазово-контрастных устройств, в результате чего микроорганизмы и отдельные части микробной клетки становятся контрастными и видимыми человеческим глазом.

В электронном микроскопе вместо световых лучей используется поток электронов, излучаемых специальным источником (электронная пушка). На пути потока электронов помещены электромагнитные линзы, которые для электронных лучей являются фокусирующими, т. е. действуют подобно линзам для световых лучей. Исследуемый препарат, приготовленный на тончайшей пленке, помещают в безвоздушной среде на пути потока электронов после их прохождения через конден-

8

сорную линзу. Затем пучок электронов проходит через объективную и проекционные линзы. Изображение микроскопируемого объекта наблюдают на флюоресцирующем экране. Возникновение изображения на экране обусловлено тем, что различные части исследуемого объекта обладают неодинаковой проницаемостью для электронов.

Электронная микроскопия дает возможность изучать объекты величиной 10–10 000 нм. Ее широко применяют для исследования тончайших структур бактериальной клетки и функциональных особенностей ее компонентов, для изучения морфологии и биологических свойств вирусов и фагов.

В сканирующем-зондовом микроскопе используют комбинации ин-

вертированного оптического и зондового микроскопов. Принцип работы атомно-силового микроскопа основан на регистрации силового взаимодействия между поверхностью исследуемого образца и зондом. Минимальный шаг сканирования составляет 0,01 нм. Сканирующаязондовая микроскопия применяется для определения плотности и размеров бактерий и вирусов, определения параметров состояния мембран (эластичности, проводимости), исследования структуры ДНК, особенностей биомакромолекул и антигенов поверхности клеток. Перспективным направлением считается совмещение сканирующих зондовых микроскопов с другими традиционными и современными методами исследования, например, совмещение с оптическим или электронным микроскопом.

Микроскопировать нативные препараты бактерий

При микроскопировании живых микроорганизмов можно, наряду с формой бактерий, наблюдать за их подвижностью, а также определить количество клеток в исследуемом объеме. Живые микроорганизмы исследуют в препаратах «висячая» и «раздавленная» капля.

Задания

1. Ознакомиться с основным оборудованием микробиологической лаборатории, с лабораторной посудой, оборудованием рабочего места.

Микробиологическая лаборатория должна иметь лабораторные столы, покрытые материалами (линолеум, пластик), которые хорошо моются и могут подвергаться обработке дезинфицирующими растворами; винтовые табуреты, удобные как для микроскопирования, так и для другой работы; шкафы для посуды питательных сред, реактивов.

9

Необходимым оборудованием микробиологической лаборатории являются: термостат, автоклав, сушильный шкаф, микроанаэростат, компрессор, холодильники, центрифуги, весы лабораторные и аналитические. Лаборатория оснащается необходимой посудой и инструментарием: пробирки бактериологические, серологические и центрифужные, чашки Петри, пипетки градуированные и пастеровские, стекла предметные и покровные, наборы инструментов, шприцы, стерилизаторы для инструментов, водяные бани, аппаратура для фильтрования и др. Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми питательными средами, химическими реактивами, диагностическими сыворотками и другими лабораторными материалами.

Лабораторный стол оборудуется биологическим микроскопом, иммерсионным маслом, газовыми горелками (или спиртовками), бактериологической петлей, дезинфицирующим раствором, штативом для пробирок. Для окраски препаратов на столе должны находиться набор красителей, спирт, фильтровальная бумага, эмалированный кювет, емкость с водой, предметные стекла, пинцет для извлечения стекол, банка для отработанных стекол.

2. Освоить особенности работы с иммерсионной системой микроскопа при исследовании готовых препаратов.

При иммерсионной микроскопии окрашенных препаратов необходимо создавать хорошее освещение, для чего надо максимально поднять конденсор, открыть диафрагму конденсора, поставить малый сухой объектив на расстоянии 5–7 см от предметного столика и с помощью плоского зеркала установить равномерное освещение поля зрения. При работе с иммерсионной системой во избежание порчи объектива необходимо соблюдать следующие правила: после нанесения на поверхность препарата небольшой капли иммерсионного масла под контролем глаза сбоку погрузить в нее фронтальную линзу иммерсионного объектива, а затем, глядя в окуляр, при помощи сначала макрометрического, а затем микрометрического винта установить препарат в фокусе микроскопа. Микроскопирование необходимо проводить, не снимая руки с микрометрического винта, что дает возможность, изменяя фокусное расстояние, рассмотреть всю поверхность поля зрения. После работы иммерсионная система и столик микроскопа должны быть очищены от масла.

10