Общая микробиология. Лабораторный практикум

В каждую пробирку засеять одну петлю суточной бульонной культуры испытуемого микроба.

Результат учитывается через сутки пребывания пробирок в термостате. Отметить наименьшую концентрацию антибиотика (наибольшее его разведение), при которой отсутствует рост микроба (бактерицидная концентрация), а также ту концентрацию при которой лишь наблюдается задержка роста культуры (бактериостатическая концентрация) по сравнению с контрольной восьмой пробиркой.

Метод градиентной диффузии

Представляет собой комбинацию методов последовательных разведений и диффузии антимикробных препаратов в агаре. Коммерческие тесты, реализующие данный подход (Etest и M.T.S.), представляют собой тонкие полоски из инертного материала, на одну сторону которых нанесена шкала значений МПК и код препарата, а на другую – градиент концентраций препарата в сухом и стабилизированном виде. При наложении тест-полоски на поверхность агара, предварительно инокулированного тестируемой культурой микроорганизма, происходит высвобождение препарата и формирование стабильного непрерывного градиента его концентраций в агаре. После инкубации вдоль тестполоски формируется эллипсовидная зона подавления роста, в месте пересечения которой с нанесённой на полоску шкалой считывается значение МПК. Преимуществом данного метода является техническая простота и широкий диапазон концентраций.

Контрольные вопросы

1.Какое действие оказывают физические факторы на микроорганизмы?

2.Как подразделяются микробы по отношению к температуре?

3.Какое действие оказывают химические факторы на микроорганизмы?

4.В чём состоит сущность опыта Бухнера?

5.По каким признакам классифицируют антибиотики?

6.Каков механизм действия антибиотиков?

7.Какими методами определяется чувствительность бактерий к антибиотикам?

41

ТЕМА 2.5. Экология микроорганизмов: распространение микробов во внешней среде и их обнаружение. Микрофлора тела человека

Микроорганизмы способны использовать любые, даже минимальные возможности для своего существования. Активная жизнедеятельность микробов, их гигантская роль в круговороте веществ в природе имеют исключительное значение для поддержания динамического равновесия всей биосферы.

Естественной средой обитания микроорганизмов служат в первую очередь почва, вода и воздух. Они заселяют также кожные покровы и слизистые оболочки человека и животных.

Наиболее благоприятные условия для своего существования микробы находят в почве. Кроме многочисленных видов бактерий и актиномицетов в почве обитают грибы, простейшие, фаги. Патогенные микроорганизмы попадают в почву с испражнениями, мочой, гноем, мокротой, слюной другими выделениями, с трупами людей и животных, погибших от инфекционных заболеваний. Сроки выживания

впочве возбудителей кишечных инфекций (дизентерии, брюшного тифа, холеры), чумы, бруцеллёза, туляремии, туберкулёза широко варьируют и составляют от нескольких часов до нескольких месяцев. Значительно дольше в почве сохраняются спорообразующие патогенные бактерии – аэробные (споры B. anthracis, возбудителя сибирской язвы, сохраняются

впочве свыше 15 лет) и анаэробные – возбудители столбняка, газовой гангрены, ботулизма (их споры также сохраняются в почве многие годы, а при благоприятных условиях прорастают и бактерии размножаются, поддерживая тем самым своё существование в почве). Для сани- тарно-бактериологической оценки почвы определяют её коли – титр – наименьшее весовое количество, в котором обнаруживаются кишечные палочки и перфрингенс – титр – наименьшее весовое количество, в котором обнаруживаются клостридии перфрингенс.

Вводе содержатся флюоресцирующие, пигментные, серо- и железобактерии, грибы, спириллы, вибрионы. Возбудители многих инфекционных заболеваний (брюшного тифа, дизентерии, сальмонеллёзов, холеры, вирусных гепатитов, полиомиелит и т. п.) выделяются вместе с испражнениями от больных и носителей и вместе со сточными водами поступают в воду открытых водоёмов. Для общей количественной оценки микрофлоры воды определяют микробное число – количество мезофильных бактерий в 1 мл воды. Для санитарно-бактериологической оценки воды определяют её коли – титр – наименьший объем воды

42

(мл), в котором обнаруживаются БГКП и коли – индекс – количество БГКП в 1 л воды.

Количество микробов в воздухе варьирует в больших диапазонах – от нескольких бактерий до десятков тысяч их в 1 м3. При санитарнобактериологической оценке воздуха закрытых помещений особое внимание обращают на содержание в 1 м3 воздуха α- и β-гемолитических стрептококков, золотистого стафилококка, которые являются показателями загрязнения воздуха верхних дыхательных путей человека.

Задания

1.Учесть результаты опыта Бухнера: отметить более обильный рост бактерий в местах, которые были закрыты бумагой.

2.Учесть результаты испытания чувствительности бактерий к антибиотикам диско-диффузиозным методом. С помощью линейки отмечается величина зоны задержки роста бактерий вокруг дисков и определяется степень чувствительности бактерий к каждому антибиотику. При диаметре этой зоны свыше 25 мм бактерий считаются высоко чувствительными, при зоне диаметром 15–25 мм – чувствительными, а при отсутствии зоны задержки роста – устойчивыми.

3.Произвести посев воздуха седиментационным методом (Коха), для чего чашку с питательным агаром поставить на горизонтальную поверхность, открыть её на 5 мин, после чего поместить в термостат. При учёте результатов подсчитывается число выросших колоний на чашке и рассчитывается микробное число воздуха, для чего используется таблица Омелянского (табл. 2.3).

Таблица 2.3

Расчёт числа микробов в 1 м3 воздуха

43

Пример: на чашке диаметром 10 см выросло 40 колоний, количество микробов в 1 м3 воздуха составляет: 40. 60=2400.

4. Произвести посев пробы почвы для определения перфрингенс – титра. Для этого приготовить разведения суспензии почвы: навеску 1 г почвы залить 10 мл стерильной воды (разведение 10–1), перемешать, 1 мл разведения перенести в 9 мл воды (разведение 10–2) и т. д. Пробирки со средой Вильсон – Блера (висмут – сульфитный агар) прогреть на водяной бане до расплавления среды, внести в пробирки по 1 мл суспензии из разных разведений, перемешать и оставить застывать в виде высокого столбика. Инкубировать в термостате. При регистрации результатов отмечается, в каком разведении появились чёрные колонии в глубине агарового столбика.

Контрольные вопросы

1.Каковы экологические среды микроорганизмов и типы экологических связей в микробиоценозах?

2.Какую роль играют свободноживущие микроорганизмы в формировании и развитии биосферы?

3.Чем характеризуется нормальная микрофлора почвы, водоёмов и воздуха?

4.Какие микробы играют санитарно-показательную роль для почвы, воды и воздуха?

5.Каково значение нормальной микрофлоры тела человека? Назовите представителей отдельных биотопов организма.

6.Что такое дисбактериоз и каковы причины его возникновения?

44

РАЗДЕЛ III

ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

ТЕМА 3.1. Вирусологический метод исследования: особенности вирусов, культивирование вирусов

Вирусы характеризуются малыми размерами тела (20–350 нм), отсутствием самостоятельных белоксинтезирующих и энергогенерирующих систем, выраженным цитотропизмом и облигатным внутриклеточным паразитизмом. Существуют в двух различных формах: внеклеточной – вирион и внутриклеточной – вирус.

Культивирование вирусов проводят в культурах клеток, органных культурах, развивающихся куриных эмбрионах, восприимчивых лабораторных животных. Широкое распространение получил предложенный в 1952 г Р. Дюльбекко метод бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественное определение вирусов. Для выделения вирусов монослой клеток после удаления питательной среды заражают вирусосодержащим материалом и покрывают слоем агара, содержащего индикатор нейтральный красный. Чашки (флаконы) инкубируют при 37 °С. Через 48–96 ч выявляются пятна – бляшки. Они имеют диаметр 1–3 м и выглядят неокрашенными на розовом фоне. Пятна возникают за счет цитопатического действия (ЦПД) вируса. ЦПД вирусов может проявляться в виде следующих изменений.

1. Равномерная мелкозернистая деструкция клеток (полиовирусы, вирусы Коксаки).

2.Очаговая мелкозернистая дегенерация клеток (вирус гриппа, клещевого энцефалита).

3.Гроздевидная дегенерация клеток (аденовирусы).

4.Крупнозернистая равномерная деструкция клеток (вирус герпеса).

5.Симпластообразование (респираторно-синцитиальный вирус, вирус кори).

Оросте вирусов в клетках можно судить и с помощью индикатора, добавляемого к питательной среде. Если клетки активно осуществляют метаболизм, рН среды сдвигается в кислую сторону, и среда окрашивается в жёлтый цвет. В случае размножения вируса клетки погибают, рН среды мало меняется, и она сохраняет первоначальный (малиновый) цвет или (при нейтральной рН) приобретает оранжевый. Некоторые вирусы, в частности, вирус гриппа, обладают особыми рецепторами (гемагглютининами), с помощью которых они адсорбируются на эритроцитах и вызывают их склеивание (гемагглютининацию). Такие виру-

45

сы легко обнаруживаются с помощью реакции гемагглютининации или гемадсорбции (эритроциты адсорбируются на инфицированных вирусами клетках культуры тканей).

Для культивирования и изучения вирусов используют органные культуры – небольшие фрагменты органов животных, культивируемые на поверхности плотной или жидкой питательной среды. В микробиологической практике для выделения, культивирования и идентификации вирусов используют куриные эмбрионы. Вирусы могут быть выделены из исследуемого материала путём заражения восприимчивых лабораторных животных (например, морских свинок, белых мышей, крыс белых, хомяков сирийских и т. п.).

Задания

1.Учесть результаты посева воздуха седиментационным методом (Коха).

2.Учесть результаты посева пробы почвы для определения перфрингенс – титра.

3.В готовых препаратах изучить характер внутриклеточных включений, образуемых вирусами.

4.Произвести заражение куриных эмбрионов.

Техника заражения куриных эмбрионов

Отобрать свежие, оплодотворенные, с хорошо просвечивающей и не имеющей трещин скорлупой КЭ. Инкубацию проводить в гнёздах штатива тупым концом яйца вверх в хорошо вентилируемых инкубаторах или термостатах при 37–37,5 °С, относительной влажности 63–65 %. Для заражения отобрать 4–13 – дневные эмбрионы с выраженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обработать спиртом, обжечь над пламенем и в области введения смазать 2 %-ной йодной настойкой. Средство ввести в аллантоисную и амниотическую полости. Проколоть ножницами небольшое отверстие в скорлупе над воздушной полостью и ввести с помощью иглы шприца исследуемый материал в количестве 0,1–0,2 мл на глубину 1–2 см. Отверстие залить парафином. При заражении в полость амниона иглу шприца или пастеровскую пипетку направить к зародышу под контролем овоскопа и ввести исследуемый материал (закрытый способ заражения). При выполнении открытого способа заражения в скорлупе над воздушной полостью вырезать отверстие размерами 0,5–0,7 х 0,5 см, удалить скорлупную оболочку, вскрыть хорионаллан-

46

тоисную оболочку, захватить пинцетом амниотические оболочки и ввести в полость исследуемый материал. Отверстие в скорлупе закрыть покровным стеклом, смоченным в расплавленном парафине. Зараженные КЭ поместить в термостат.

Контрольные вопросы

1.Каковы особенности структурной организации вирионов?

2.Каковы особенности химического состава вирионов?

3.Какие признаки лежат в основе систематики вирусов?

4.Каковы особенности вирусных нуклеиновых кислот и белков?

5.Чем характеризуется продуктивный тип взаимодействия вирусов

склетками?

6.Чем характеризуется абортивный тип взаимодействия вирусов

склетками?

7.Чем характеризуется интегративный тип взаимодействия вирусов с клетками?

8.Какими методами производится культивирование вирусов?

9.Что собой представляют перевариваемые тканевые культуры?

10.Что такое цитопатическое действие вируса и как оно может проявляться?

11.Какими методами производится заражение куриного эмбриона?

12.Что собой представляют внутриклеточные включения, образуемые вирусами?

ТЕМА 3.2. Методы работы с бактериофагами

Бактериофаги являются вирусами, паразитирующими в бактериальной клетке. На основании формы и строения различают пять морфологических типов бактериофагов: с длинным отростком, футляр которого сокращается; с длинным несокращающимся отростком; с коротким отростком; с аналогом отростка и нитевидные фаги. Первые три морфологические типа содержат двунитчатую ДНК, четвёртый – однонитчатую ДНК или РНК, пятый тип – однонитчатую РНК. Головка бактериофага образована белковыми капсомерами и имеет, как правило, полигональную форму. В её полости располагаются плотно скрученная ДНК или РНК, а также несколько аминов. Отросток, соединяющийся с головкой, шейкой, предназначен для прикрепления к рецепторам бактериальной клетки и её инфицирования. Бактериофаги в зависимости

47

внести в пробирки 0,2–0,3 л бульонной культуры чувствительных бактерий и 1 мл фага из соответствующего разведения, перемешать, быстро вылить в чашку с агаром и распределить равномерно по её поверхности путём покачивания. После застывания агара чашки инкубировать

втермостате при температуре 37°С.

4.Провести типирование бактерий с помощью бактериофагов. На агаровую поверхность в чашке Петри вылить 1 мл бактериальной суспензии, покачиванием чашки равномерно распределить бактерии, остаток культуры удалить пипеткой. На сектора чашки нанести петлей типовые фаги. После подсыхания капель чашки поместить в термостат.

5.Поставить опыт Ньюкомба. На 4 чашки с питательным агаром было засеяно по 0,1 мл бактериальной суспензии. Чашки инкубировались 4 часа до появления первых признаков видимого роста. На 2 чашках произвести перераспределение бактерий путём растирания стеклянным шпателем поверхности среды, после чего на все чашки налить по 1 мл вирулентного бактериофага и покачиванием чашки распределить его равномерно по всей поверхности чашки. Посевы поставить в термостат

при температуре 37 °С.

Контрольные вопросы

1.Каковы основные особенности бактериофагов?

2.Какие существуют морфологические типы бактериофагов?

3.Какими особенностями характеризуются фаговые нуклеиновые кислоты и белки?

4.Каковы особенности взаимодействия бактериофагов с клеткой хозяина?

5.В чём различия между вирулентными и умеренными фагами? Что такое лизогения?

6.Из каких объектов производится выделение бактериофагов?

7.Какое практическое применение находят бактериофаги?

8.Что собой представляет титр фага и как он определяется?

9.Каков принцип метода фаготипирования? С какой целью его производят?

10.В чём сущность опыта Ньюкомба?

11.Как выявляют результаты заражения куриных эмбрионов?

49

ТЕМА 3.3. Генетические методы исследования микроорганизмов

У большинства микроорганизмов в большей степени, чем у высших организмов, выражена изменчивость, что связано с коротким периодом генерации, большей частотой мутаций, генетическим обменом, выходящим за пределы вида. Различают фенотипическую и генотипи-

ческую изменчивость. Фенотипической изменчивости (модификации)

свойственны высокая частая реверсия в исходную форму, адаптивный к среде характер сдвигов, отсутствие изменений в генетическом коде. По наследству не передаётся. Проявляется в виде полиморфизма клеток, временной потери жгутиков, диссоциации на S- и R-формы колоний, образования нестабильных L-форм бактерий и т. д. Изменчивость генотипическая наступает в результате мутаций и рекомбинаций. Ей присущи низкая частота, редкость реверсий, случайный (не адаптивный) характер сдвигов, она сопровождается изменением генетического кода и передачей приобретенных признаков потомству. В результате мутаций могут изменяться различные признаки микроорганизмов (морфологические, биохимические, антигенные и др.). Рекомбинациями называют процессы обмена генетическим материалом между двумя микробными клетками, которые могут происходить в результате трансформации (проникновения фрагментов ДНК донора в клетку реципиента без непосредственного контакта между бактериальными клетками), трансдукции (переноса фрагментов ДНК донора в клетку реципиента с помощью бактериофага), конъюгации (переноса части хромосомы донора в клетку реципиента при непосредственном контакте между двумя бактериальными клетками).

Задание

1.Учесть результаты титрования бактериофага, рассчитать титр фаговой суспензии, для чего подсчитать число образовавшихся негативных колоний на чашке и умножить полученное число на показатель разведения фага.

2.Учесть результаты опыта фаготипирования.

3.Учесть результаты опыта Ньюкомба: подсчитать число колоний на контрольных и перераспределенных чашках. Сделать вывод.

4.Изучить фенотипическую изменчивость бактерий – влияние фенола на подвижность бактерий. Бактериальную культуру вырастить в МПБ

ив бульоне с 1 % фенола. Исследовать её подвижность методом «раз-

50