Общая микробиология. Лабораторный практикум

Контрольные вопросы

1.Какую роль выполняют вода, минеральные соли, углеводы и липиды в микробной клетке?

2.Как классифицируют микроорганизмы по типам питания?

3.Каковы особенности автотрофных и гетеротрофных микроорганизмов?

4.В чём состоит строительный и энергетический обмен у микробов?

5.Какие продукты образуются в результате строительного и энергетического обмена микроорганизмов?

6.Какие требования предъявляются к питательным средам? Что такое ростовые факторы?

7.Как классифицируются питательные среды? Привести примеры основных категорий питательных сред.

8.Что такое стерилизация и дезинфекция?

9.Какие существуют методы стерилизации питательных сред и лабораторной посуды?

10.Основные методы приготовления питательных сред (МПА, МПБ).

11.Что представляет собой процесс дыхания у микробов?

12.На какие типы разделяют микроорганизмы по способу дыха-

ния?

13.Каковы характерные черты аэробного типа дыхания?

14.В чём особенности анаэробного типа дыхания? Что такое бро-

жение?

15.Какие существуют методы создания анаэробиоза?

16.Как происходит размножение бактерий?

17.Что такое «число бактерий» и «микробная масса»?

18.Перечислить фазы развития бактериальной популяции в жидкой питательной среде?

19.Что такое время генерации бактерий и как оно определяется?

20.В чём заключается способ непрерывного культивирования бак-

терий?

21.Что такое «синхронная культура» и как её получают?

22.Что собой представляет чистая культура бактерий?

23.Какие этапы включает выделение чистых культур бактерий?

24.Какие существуют техники первичного посева исследуемого материала?

31

ТЕМА 2.2. Бактериологический метод: техники пересева чистой культуры

Получив изолированные колонии, из колоний с различной характеристикой или содержащих различные по форме и окраске бактерии делают пересев бактерий. Выделяют следующие техники пересева.

Техника посева проб в пробирки со скошенной средой

Обычно на скошенные среды переносят культуру с колоний на чашках. Для этого необходимо приподнять крышку чашки Петри и стерильной петлёй прикоснуться к колонии. После этого в левую руку берут пробирку со скошенным агаром (между большим и указательными пальцами) так, чтобы поверхность скошенного агара была перед глазами. Пробирку открывают над пламенем горелки, обжигают её край, а затем петлю вводят в пробирку до дна, где имеется небольшое количество конденсационной воды. Плоской поверхностью петли прикасаются к поверхности агара и делают посев штрихообразными движениями, постепенно продвигаясь снизу вверх. Обжигают в пламени край пробирки и пробку, закрывают пробирку над пламенем.

Техника посева в жидкую среду

Простерилизованной бактериологической петлей отбирают материал, наносят его на стенку пробирки у верхнего уровня среды и, слегка встряхивая пробирку, смывают его средой. Край пробирки и пробку обжигают, быстро закрывают.

Техника посева бляшкой

При определении некоторых свойств исследуемых культур бактерий на плотных средах производят плотный посев на ограниченном участке среды в виде прямоугольника, овала, круга размерами 0,5–0,8 х 1–1,5 см. Между бляшками следует выдерживать расстояние в несколько см.

Техника посева в конденсационную воду

Выбирают свежескошенную среду, содержащую на дне каплю конденсационной жидкости. Исследуемую культуру забирают петлей и вносят в конденсационную воду. У выраженно подвижных культур рост бактерий с конденсационной воды распространяется на влажную поверхность скошенной среды. С верхней части роста бактерий производят пересев в конденсационную воду второй пробирки и т. д. Методика позволяет получить чистую культуру подвижных бактерий (например, протея, возбудителя столбняка).

32

Техника посева в верхнюю часть скошенной среды

Материал наносят в виде бляшки на верхнюю часть свежескошенной среды. Пробирки помещают в термостат в вертикальном положении и наблюдают за сползанием культуры вниз по поверхности скошенной части, которое характерно для слизистых штаммов.

Техника посева уколом в столбик плотной или полужидкой среды

Используют высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды, полускошенные плотные среды. Во всех случаях бактериальной петлей или иглой с посевным материалом делают прокол среды с поверхности до дна. Пробирку рекомендуют держать дном вверх, чтобы не наступила контаминация среды воздушной микрофлорой.

После инкубации изучают изолированные колонии. Колонии обладают набором определенных признаков:

а) размеры – большие (диаметр более 4–5 мм), средние (диаметр 2–4 мм), мелкие (диаметр менее 1–2 мм) и микроскопические (диаметр менее 1 мм);

б) цвет – белый, жёлтый, сине-зелёный, бурый, чёрный, цвет среды и др.;

в) форму – круглая, лаптеобразная, розеткообразная и др.; г) края – ровные, волнистые, зазубренные, отростчатые и др.;

д) поверхность – гладкая, шероховатая, блестящая, матовая, плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная и др.;

е) консистенция – сухая, пастообразная, слизистая, однородная, зернистая;

ж) прозрачность – прозрачная, мутная.

Для определения морфологии клетки и их тинкториальных свойств из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму. Оставшуюся часть колонии отсевают на скошенный питательный агар.

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых сводится к удалению кислорода из среды. Условия анаэробиоза создают различными способами:

1. Физические:

а) удаление воздуха при помощи насоса из герметически закрывающегося прибора – анаэростата;

б) удаление воздуха из среды при помощи кипячения с последующим быстрым охлаждением и заливкой среды стерильным вазелиновым маслом;

33

в) внесение в жидкую питательную среду кусочков печени, мяса, почки, которые поглощают кислород;

г) посев в высокий столбик агара, который затем заливается слоем вазелинового масла для предотвращения доступа воздуха;

д) использование трубок Вейон – Виньяля: в стеклянную трубку длиной около 30 см и диаметром 3–4 мм насасывают расплавленный агар, засеянный микробами, трубку запаивают с обоих концов, для выделения колоний у нужного места трубку надламывают и производят отсев бактерий.

2. Химические:

а) добавление в питательную среду веществ, редуцирующих кислород (например, глюкозу, глутатион, пировиноградную кислоту и др.);

б) добавление в атмосферу роста химических веществ, поглощающих кислород (например, щелочного пирогаллола).

3. Биологический (метод Фортнера): совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов на кровяном агаре с глюкозой в запаранифинированной чашке Петри.

Задания

1.Изучить колонии на чашках: определить размеры колоний, форму, поверхность, характер края, прозрачность колонии, наличие пигмента, консистенцию. Из части колонии приготовить мазок, окрасить по Граму, микроскопировать. Зарисовать и записать морфологию бактерий.

2.Отсеять оставшуюся часть колонии, используя различные техники пересева.

3.Ознакомиться с методами создания анаэробиоза.

Контрольные вопросы

1.Какие существуют техники пересева бактерий?

2.Какие признаки колоний имеют дифференциальное значение?

3.Какую роль играют пигменты бактерий?

4.Почему пигмент у одних бактерий окрашивает только колонии,

ау других – колонии и питательную среду?

5.Физические способы создания анаэробиоза.

6.Химические методы создания анаэробиоза.

7.Биологический метод создания анаэробиоза.

34

ТЕМА 2.3. Бактериологический метод: изучение биохимических свойств бактерий

Идентификация микробов представляет собой определение систематического положения выделенной из какого-либо источника культуры до уровня вида, для чего используют комплекс признаков: морфологических, химических, культуральных, биохимических, серологических, экологических. Для установления вида, рода и особенно варианта бактерий применяют определение биохимических признаков, так как каждый вид характеризуется определенным набором ферментов. Для дифференциации бактерий выявляют у них протеолитические, сахаролитические, антиоксидантные, гемолитические ферменты, а также способность бактерий к редукции некоторых веществ (красители, нитраты и др.).

Протеолитическая активность бактерий определяется их способностью разжижать желатин, свернутую сыворотку крови, образовывать при расщеплении белков индол, сероводород, аммиак.

Сахаролитические свойства бактерий выявляются в способности ферментировать углеводы с образованием различных кислых продуктов и газообразных веществ. Для этого используют короткий и длинный «пёстрый» ряд. Первый включает в себя среды Гиса с монодисахаридами (глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой) и с шестиатомным спиртом – маннитом. В длинный «пёстрый» ряд вводят дополнительно среды с моносахаридами, полисахаридами и спиртами. В качестве индикатора во все среды добавляют реактив Андраде (щелочной раствор кислого фуксина).

Чистую культуру исследуемых бактерий засевают на среды «пёстрого» ряда. Если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляются пузырьки газа. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется.

Антиоксидантная активность бактерий заключается в способности разлагать активные формы кислорода, секретируемые активированными макрофагами. Основную роль играет фермент каталаза, разлагающая перекись водорода, и супероксиддисмутаза, разрушающая супероксиданион радикал.

Гемолитическая активность бактерий проявляется в способности расщеплять гемоглобин. В зависимости от полноты разложения гемоглобина выделяют три вида гемолитической активности – α, β, γ. Выявляют наличие этих ферментов при посеве на кровяной агар.

35

Задания

1.Просмотреть посевы на скошенном агаре, приготовить мазки, окрасить по Граму, микроскопировать.

2.Засеять чистую культуру в пробирку с мясо-пептонным бульоном для определения протеолитических свойств бактерий. Под пробку для выявления индола, сероводорода, аммиака. Обнаружение индола производится при помощи фильтровальной бумаги, пропитанной раствором щавелевой кислоты, высушенной и разрезанной на узкие полоски. В случае образования индола бумажка окрашивается в розовый цвет. При наличии сероводорода бумага, пропитанная раствором уксуснокислого свинца, чернеет. С целью выявления аммиака применяют лакмусовую бумажку, которая в положительном случае синеет.

3.Засеять исследуемую культуру на среды «пёстрого» ряда: с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом. Посев следует произвести уколом в столбик полужидкого агара, содержащего углевод и индикатор,

затем инкубировать при температуре 37 °С в течение 18–24 ч.

4. Определить наличие у бактерий каталазы, для чего на предметное стекло нанести каплю 3 %-ного раствора Н2О2 и внести в неё петлю бактериальной культуры. Каталаза разлагает Н2О2 на воду и кислород. Выделение пузырьков кислорода свидетельствует о наличии у данного вида бактерий фермента каталазы.

Контрольные вопросы

1.Какими методами осуществляется идентификация бактерий?

2.Классификация бактериальных ферментов по механизму их дей-

ствия.

3.Классификация бактериальных ферментов по субстрату.

4.Классификация бактериальных ферментов по генетическому контролю их синтеза.

5.Как производится определение протеолитических свойств бактерий?

6.Каким путём определяют наличие у бактерий сахаролитических свойств?

7.Как выявляют у бактерий наличие фермента каталазы?

8.Каков принцип определения у бактерий редуцирующих свойств?

36

ТЕМА 2.4. Бактериологический метод: изучение биохимических свойств бактерий (окончание). Действие внешних факторов на микроорганизмы, антибиотики

Микроорганизмы, находящиеся во внешней среде, подвергаются воздействию разнообразных физических, химических и биологических факторов. Каждый вид имеет свои наследственные, закрепленные зоны влияния отдельных факторов. Среди физических особое значение в жизни микробов имеет температура. В зависимости от температурных параметров выделяют три группы микроорганизмов – термофилы, психрофилы и мезофиллы. Для термофилов зона оптимального роста равна 50–60 °С, верхняя зона задержки роста 75 °С, нижняя 45 °С. Психрофилы имеют зону оптимального роста в пределах 10–15 °С, максимальную зону задержки роста 25–30 °С, минимальную 0–5 °С. Некоторые виды холодолюбивых бактерий, размножаясь в пищевых продуктах при температуре бытового холодильника, вызывают заболевания у человека. Патогенные бактерии и большинство микробов – сапрофитов являются мезофиллами. Оптимальная температура их роста колеблется в пределах 30–37 °С, максимальная 43–45 °С, минимальная 15–20 °С.

Губительное действие на микроорганизмы оказывают высушивание, ионизирующая радиация, УФ-лучи, ультразвук. Химические вещества, обладающие противомикробным действием (галогены, окислители, кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов и т. д.). Самые эффективные дезинфицирующие средства «Alpet R», «Smart San», «Ника», «Ди-хлор», «Дезэффект».

Микробные ассоциации зависят не только от факторов внешней среды, но и от сложных взаимоотношений микроорганизмов, которые могут носить характер симбиоза или антагонизма. Антагонистические свойства микробов могут быть обусловлены разными механизмами. Один из них – образование антибиотических веществ. Среди микроорганизмов продуцентами антибиотиков являются актиномицеты, грибы и бактерии.

Антибиотики – химиотерапевтические вещества биологического, полусинтетического или синтетического происхождения, которые в малых концентрациях вызывают торможение размножения или гибель чувствительных к ним микробов и опухолевых клеток во внутренней среде животного организма.

По направленности действия все антибиотики делят на следующие группы: противобактериальные, противовирусные, противогрибковые, противопротозойные, противоопухолевые. Они могут обладать узким

37

(например, бензилпенициллин), умеренным (например, ампициллин) или широким (например, аминогликозиды, тетрациклины) спектром действия.

По химическому составу антибиотики подразделяют на несколько групп.

1.Бета – лактамные антибиотики, включающие природные пенициллины, несколько поколений полусинтетических пенициллинов, несколько поколений цефалоспоринов, нетрадиционные бета – лактамы.

2.Стрептомицины и стрептомициноподобные антибиотики.

3.Макролиды – эритромицин, олеандомицин, карбомицин.

4.Аминогликозиды – гентамицин, неомицин, канамицин.

5.Тетрациклин и его полусинтетические производные.

6.Гликопептиды – ристомицин, линкомицин, ванкомицин.

7.Левомицетин – синтетическое вещество, идентичное природному антибиотику, хлорамфениколу.

8.Производные параамино – салициловой кислоты (препараты ПАСК – противотуберкулёзные антибиотики), изокотиновой кислоты,

атакже рифампицины и др.

9.Фосфомицины – антибиотики из группы фосфоновой кислоты.

10.Фторхинолоны – неприродные соединения (ципрофлоксацин, ципробан и др.).

11.Полиеновые антибиотики – нистатин, леворин, амфотерицин В. По механизму антимикробного действия антибиотики отличаются

друг от друга. Мишенью для их ингибирующего действия служит одна или несколько биохимических реакций, необходимых для синтеза и функционирования определенных структур микробной клетки (табл. 2.1).

Таблица 2.1

Механизмы ингибирующего действия некоторых групп антибиотиков на микробную клетку

38

Задания

1.Просмотреть посевы на средах «пёстрого ряда» и в мясо – пептонном бульоне. Зарегистрировать результаты. Образование индола, сероводорода, аммиака обозначается «+», отсутствие «–». Ферментация углевода с образованием кислоты (изменение окраски среды) отмечается «К», с образованием кислоты и газа (наличие пузырьков в столбике среды) – «КГ», отсутствие ферментации углеводов «–».

2.Заполнить протокол исследования чистой культуры бактерий

(см. табл. 2.2).

3.Испытать действие света на бактерии (опыт Бухнера). На поверхность агара в чашке Петри налить 1 мл бульонной культуры, равномерно распределить по поверхности, остаток удалить пипеткой. Кружочки стерильной бумаги поместить на поверхность агара и осветить открытую чашку прямыми солнечными лучами в течение 1–2 ч, после чего чашку закрыть крышкой и поставить в термостат.

Таблица 2.2

Протокол исследования чистой культуры бактерий

39

4. Произвести определение чувствительности бактерий к антибиотикам двумя методами.

Метод дисков

На поверхность агара в чашке Петри вылить 1 мл взвеси бактерий и распределить её по поверхности, остаток культуры убрать пипеткой. После высыхания поверхности чашки на её сектора нанести пинцетом диски с антибиотиками. Выдержать чашки в течение 30 мин, после чего поместить в термостат.

Метод разведений

Взять два ряда пробирок: 1–7 пробирок по 1 мл физиологического раствора; 2–8 пробирок по 2 мл бульона. В первую пробирку первого ряда внести 1 мл пенициллина, содержащий 160 единиц. Содержимое пробирки перемешать и 1 мл перенести во вторую пробирку, из второй пробирки 1 мл перенести в третью и т. д. Таким образом, в пробирках будет 80, 40, 20, 10, 5 единиц и т. д. пенициллина в 1 мл.

В каждую пробирку второго ряда (кроме восьмой) внести по 0,2 мл разведения пенициллина из соответствующей пробирки первого ряда. Получаем разведения пенициллина – 8, 4, 2, 1 и т. д. в 1 мл бульона.

40