книги из ГПНТБ / Крисс А.Е. Жизненные процессы и гидростатическое давление

ЛИАЗЫ

Дезаминирование

Дезаминирующая активность бактерий в условиях высокого давления была предметом исследования Morita (1957а). В его опытах отмытые клетки Е. coli три паса подвергались давле­ нию 1, 200, 600, 1000 атм при 30° и после декомпрессии добав­ лялись в среду со следующими аминокислотами: dl-аспарагино­ вой, 1-аланином, 1-цистеином, 1-глутаминовой кислотой, гистиди­ ном, 1-серином.

Из табл. 24 видно, кто бактериальные клетки, которые нахо­ дились под давлением 200, 600 и 1000 атм, более активно де-, заминировали dl-аспарагиновую кислоту, чем при атмосферном, давлении. Стимулирующий эффект давления 600 атм проявился и с другими субстратами — 1-аланином и 1-глутаминовой кисло­ той. Однако с 1-серином, цистеином и гистидином были получе­ ны противоположные результаты: повышение давления оказывалоингибирующее действие вплоть до полной утраты дезаминирую­ щей активности в отношении гистидина.

В другой работе (Haight, Morita, 1962) испытывалась ак­ тивность а с п а р т а з ы в условиях одновременного действия раз­ личных температур и давления на препарат этого фермента и

Рис. 47. Комбинированное действие температуры и давления (в атм) на активность аспартазы (Haight, Morita, 1962)

1 — 1 атм; 2 — 200; 3 — 400; 4 — 000; 5 — 800; 6 — 1000

80

Рис. 48. Комбинированное действие температуры и давления (в атм) иа процесс дезаминирования L-аспарагиновой кислоты отмытыми клетками Е. coli (Haight, Morita, 1962)

1 — і атм; 2 — 100; З — 200; 4 — 300; 5 — 400; S — 500;7 — 600; S — 700; э — 800; 10 — 900; и — 1000

отмытые клетки Е. coli. В ряду температур от 37 до 45° и ве­ личин давления от 1 до 1000 атм повышение активности аспар­ тазы было незначительным, соответственно закону Вант-Гоффа (рис. 47).

Резкое увеличение дезаминирующей способности фермента произошло при температурах 45 — 50° и давлении 200 — 1000 атм. Примерно иа том же уровне сохранилась продукция аммиака под высоким давлением и температурах 53 — 56°. Поскольку эта

П р и м е ч а н и е . Продолжительность инкубации смеси: для отмытых клеток с суб-, стратом — 15 мин. при 30°; для аспарагиновой кислоты — 10 мин.

81-

активность при всех величинах давления и температурах выше 45° была больше, чем в условиях атмосферного давления, оче­ видно, что взаимодействие давления и температуры обусловило данное явление.

Некоторые отличия выявились в опытах с отмытыми клетка­ ми (рис. 48). До 45° возрастала дезаминирующая активность клеток: максимальный уровень снижался с повышением давления от 1 до 1000 атм.

Дальнейший подъем температуры с 45 до 50° вызвал резкое падение кривой и не только при 1 атм, где можно было ожи­ дать тепловую инактивацию клеток, но и под давлением 100, 200, 300, 400 и 500 атм. Однако степень потери активности уменьшалась с повышением давления при этих величинах. На­ чиная с 600 атм и до 1000 атм, наблюдалось некоторое повыше­ ние активности клеток.

В пределах температуры 50—53° снижение активности стало заметным также у клеток, дезаминирующая активность которых определялась под давлением 600, 700, 800 атм. При 900 атм активность их не изменилась, а давление 1000 атм даже усили­ ло ее. Опыты с температурой 56° дали неожиданный результат: наибольшая активность клеток отмечалась под давлением 100 атм, а наименьшая — в условиях атмосферного давления.

ПЗОМЕРАЗЫ

И н в е р та за

Basset et Macheboeuf (1932) и Macheboeuf et Basset (1934) исследовали активность ипвертазы при разных величинах давления. У одного препарата ипвертазы активность пе меня­ лась заметно через 30 мин. пребывания под давлением 4000 и 6000 атм, ио при 10 000 атм сохранялось только 5% активности.

нии, не было также различий в концентрации молочной кислоты (Deuticke, Harren, 1938). Однако повышение давления до 2000 атм сказалось в виде полного отсутствия гликолиза и сохранения молочной кислоты на уровне исходного количества.

Ингибирующее действие давления 800 атм не наблюдалось авторами и в опытах с тростниковым сахаром, к раствору кото­ рого добавлялась инвертаза. Через 5 час. экспозиции при высо­ ком давлении и атмосферном давлении результаты были иден­ тичными.

82

Количество сахара в крови у кроликов уменьшалось одина­ ково вне зависимости от использования препаратов инсулина, подвергавшихся давлению 5000 — 10 000 атм или находившихся при атмосферном давлении. Примечательно, что активность ин­ сулина сохранялась полностью, когда он коагулировался трех­ часовым пребыванием под давлением 10 000 атм. Хотя внешний вид коагулированного инсулина не отличался от коагулятов яич­ ного белка или пепсина, полученных нагреванием, физиологиче-

Рис. 51. Влияние температуры на скорость гидролиза сахарозы под давлением 680 атм (2) и при атмос­ ферном давлении (1) (Eyring et al., 1946)

1, г — при pH 4,5; Іа, 2а — при pH 7,03—7,07

к - 1 0 s

83

ское действие его проявлялось в такой же степени, как у натив­ ного фермента.

Активность дрожжевой ийвертазы под давлением в не­ сколько сот атмосфер в зависимости от ее концентрации, pH и температуры изучали Eyeing, Johnson а. Gensler (1946). Из рис. 49 видно, что с повышением концентрации фермента от 0,2 до 1% пропорционально возрастала скорость гидролиза саха­ розы, причем она была выше на 33% под давлением 476 атм, чем при атмосферном давлении.

Величина pH оказывала влияние на эффект давления. При одной атмосфере скорость гидролиза была максимальной при pH 4,5. На 5% она была больше под давлением 476 атм. Однако под этим давлением в условиях pH среды 7,5 и 1,5 скорость возрастала на 58 и 38% соответственно (рис. 50). Под давле­ нием 680 атм и pH 4,5 максимальная скорость гидролиза на­ блюдалась при 50°; энергия активации приблизительно равнялась

составляла 8700 кал для нормального давления и 9400 кал для 680 атм; максимальная скорость наблюдалась при 30°, выше кото­ рой наступала инактивация инвертазы (рис. 51).

При добавлении уретана скорость гидролиза, которая в усло­ виях атмосферного давления и pH 4,5 была максимальной при температуре 60°, снижалась в результате дальнейшего нагрева в большей степени, чем в растворе инвертазы и сахарозы без уретана. Повышение давления до 680 атм значительно уменьшало ингибирующее действие уретана на фермент при высоких темпе­ ратурах (Johnson et ah, 1948).

В аналогичных условиях опыта, при pH 7,0, скорость инвер­ сии сахарозы достигала максимума в условиях нормального дав­ ления не при температуре 60°, а при 35°. Выше 35° уретан заметно снижал скорость гидролиза. Однако этому падению противодейст­ вовало высокое давление, оно ускоряло процесс инверсии (рис.52).

ИНДУКЦИЯ, ТРАНСФОРМАЦИЯ, ТРАНСЛЯЦИЯ И ТРАНСКРИПЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

Процессы индукции, трансформации, трансляции и транскрип­ ции ß-галактозидазы в клетках Е. coli под высоким давлением были исследованы Landau (1967). Индуцирующим веществом служил изопропилтиогалактопиранозид, в качестве ингибитора синтеза РНК применяли профлавин и борат натрия.

В первых опытах индуктор добавляли при 1 атм. Через 20 мин. давление повышалось, и затем: спустя 10 мин. производилась де­ компрессия. Оказалось, что давление 265 атм по своему влиянию на синтез фермента не отличалось от атмосферного давления, при 400 и 535 атм синтез снижался и полностью прекращался

84

Рис. 52. Скорость гидролиза сахарозы в зависимости от присутствия уретана (0,5 М) и от действия давления (в атм) при 30°, pH 7,0 (Johnson et al., 1948)

С уретаном: i — 1 атм; 2 — ПО; з — 510; l', 2', s' — то же без уретана (контроль)

под давлением 670 атм. После снятия давления синтез тотчас же возвращался к норме (рис. 53). Дальнейшие опыты показали, что в случае добавления профлавина или бората натрия немед­ ленно после снятия давления синтез продолжался еще при 670 атм за счет пресинтезированной РНК, тогда как одновременное при­ менение давления и индуктора приводило к полному блокирова­ нию синтеза ß-галактозидазы уже при 265 атм.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ПОД ДАВЛЕНИЕМ

Бреслер и его сотрудники предприняли попытку применить высокое давление для сдвигов химического равновесия в сторону синтеза, использовав гидролитические ферменты и продукты их действия.

В первой работе (Бреслер, 1947) желатину и сывороточный глобулин гидролизовали трипсином, а затем гидролизаты с этим ферментом помещали под давление 6000 атм на 8 час. Образо­ вывался гель, который не возникал, если трипсин инактивиро­ вался кипячением. Ресинтез происходил также, когда раствор, ко­ торый содержал крахмал, гидролизованный амилазой до отсутст­

давлением несколько тысяч атмосфер квазибелки из белковых гидролизатов; гидролиз производился трипсином, эрепсином и папаином. По своим физико-химическим свойствам эти продукты

■ 85

Т а б л и ц а 25. Ресиитез белков под давлением (Бреслер, Гликина, 1947)

напоминали исходные белки (табл. 25). Гидролиз и последующий ресинтез белка им удавалось повторять многократно под дейст­ вием одной и той же порции фермента.

Ферментативная функция белка могла восстанавливаться при ресинтезе его под давлением (Бреслер и др., 1949а). Мышечный белок — миоген, который является ферментом альдолазой, гидро­ лизовали трипсином, а затем ставили под давление 4000 атм на 4—5 час. В этих условиях происходил ресиитез миогена, од­ нако его активность была значительно слабее первоначальной.

Авторы также сообщили о возможности синтеза под давле­ нием ди- и трипептпдов из гликокола, лейцина, фенилаланина и глутаминовой кислоты панкреатином и ферментом из слизистой кишечника. Активаторами ферментов служили марганец и ко­ бальт.

В последующих исследованиях выяснилось, что под давле­ нием ресинтезируются исходные антигенные свойства белка (Бреслер и др., 1949 б,в). Гидролизат сывороточного альбумина не обладал аитигенностью, но после давления (6000 атм) ресин­ тезированный альбумин вновь обретал антигенную специфичность, хотя и отличался по своим физико-химическим свойствам от на­ тивного белка (табл. 26).

Другое биологическое свойство — гормональная активность белка также частично возвращалась к инсулину после ресинте­ за его под давлением, как и характерная для этого гормона кон­ станта седиментации (Бреслер и др., 1951).

Ресинтезированный сывороточный альбумин сохранял способ­ ность к кристаллизации, хотя при ресинтезе образовывались мак­ ромолекулы белка, не вполне одинаковые по макроструктуре, су­ дя по разбросу молекулярных весов (Бреслер, Селезнева, 1952).

Ресинтез макромолекул белка происходил скачком, образовы­ вались сразу же молекулы в основном того же размера, что и у

86

Т а б л и ц а 2G. Реакция преципитации разных препаратов ссрумальбумина ішмуішымп сыворотками (Бреслер и др. 1949)

Сыворотки к антигену

нативного белка. С коммерческими препаратами степень ресин­ теза была выше, чем в опытах с кристаллическими ферментами, но было замечено, что не каждый фирменный препарат фермента пригоден для проведения ресинтеза под давлением (Бреслер и др., 1952).

В последней экспериментальной работе по ферментативному ресинтезу под давлением Бреслер и Френкель (1953) указывают, что реакцию амилолиза, хотя и удается обратить в сторону син­ теза давлением 6000 — 8000 атм, однако высокомолекулярные со­ единения не образуются. Выяснилась неспособность амилаз ката­ лизировать реакцию соединения декстринов между собой.

Поскольку французским исследователям (Macheboeuf et ab, 1950; Talwar, Macheboeuf, 1954) не удалось в своих работах подтвердить опыты Бреслера но ресинтезу, Бреслер (1955) от­ мечает, что они ие учли в своих исследованиях важнейшее ус­ ловие — чистоту ферментов и субстрата. При длительном хране­ нии растворов чистых ферментов в рефрижераторе может проис­ ходить их заражение различными видами микроорганизмов, кото­ рые выделяют свои ферменты, и возникающие смеси различных ферментов перестают катализировать ресинтез под давлением.

МИКРООРГАНИЗМЫ И ГИДРОСТАТИЧЕСКОЕ ДАВЛЕНИЕ

Как к при действии различных физических и химических факторов, существует порог, за которым высокое давление вызы­ вает смерть организма. Значительная часть работ в этой обла­ сти, особенно ранних, посвящена вопросу об устойчивости микро­ организмов к повышенному гидростатическому давлению. Многие исследователи интересовались способностью бактерий, актиномицетов, микроскопических мицелиальных грибов размножаться под давлением в несколько сот атмосфер, морфологическими и цито­ логическими изменениями в клетках микробов, сдвигами в об­ мене веществ и другими физиологическими явлениями, возни­ кающими в результате действия высокого давления.

УСТОЙЧИВОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ К ДАВЛЕНИЮ

Вегетативные клетки

Certes (1884с) помещал настой редиса с листьями на несте­ рильной морской воде под давлением 350—500 атм на 42 дня. Развивавшиеся в большом числе бактерии имели меньшие разме­ ры, чем в контрольных пробирках, находившихся при атмосфер­ ном давлении. После десятиминутного нагревания на водяной бане с кипящей водой настой в пробирках, бывших под давле­ нием, становился стерильным, тогда как в контроле (при атмос­ ферном давлении) бактерии сохраняли жизнеспособность. В дру­ гих опытах, проведенных совместно с Roux, было обнаружено, что палочка сибирской язвы выдерживала давление 600 атм в течение 24 час., сохраняя вирулентность.

Regnard (1884а) показал, что микроорганизмы могут не те­ рять жизнеспособность под давлением 1000 атм. Он помещал пив­ ные дрожжи под такое давление на один час, а затем переносил Их в питательную среду. Брожение начиналось не сразу, а спустя некоторое время. Не погибали дрожжевые организмы и тогда, коіч да они находились в питательной среде 7 час. под давлением 600 атм. Но брожение в среде начиналось только через час после снятия давления.

88

Однако молоко, зараженное кусочком старого сыра, не свер­ тывалось после десятичасового пребывания под давлением 700 атм

изатем хранения при 1 атм в течение трех-четырех дней. В конт­ роле молоко быстро коагулировало. Не наблюдалось также разло­ жения мочевины, если ее помещали в гниющую воду на три недели под давление 650 атм. Такие же результаты были получе­ ны в опытах с яйцом и мясом. Под давлением 700 атм в яйце

имясе не происходили изменения, которые свидетельствовали бы об их порче; продолжительность опытов составляла, 18 и 40 дней.

Вконтрольных пробирках разложение начиналось очень быстро.

Висследованиях Roger (1895) золотистый стафилококк, ро­ жистый стрептококк, кишечная палочка и чумная бактерия под­ вергались давлению 1000 атм продолжительностью 5—6 мин. че­ тыре раза подряд. Эти условия опыта не повлияли на способность бактерий к размножению. Никаких изменений также не наблюда­ лось в культурах золотистого стафилококка и кишечной палочки псісле десятиминутного пребывания этих бактерий под давлением 3 000 атм. Однако часть клеток рожистого стрептококка и чумной бактерии погибла, судя по меньшему, чем в контроле, числу выросших колоний.

По данным Hite (1899), сырое молоко удается стерилизо­

rosea, Bacterium pyocyaneum, Bact. prodigiosum, Bact. typhi ab­ dominalis, Bact. typhi murium, Bact. pneumoniae cruposae, Bact.

-до 3000 атм не убивало эти микроорганизмы. По толерантности

Авторы отмечают возрастание вредного действия'давления по мере его повышения и удлинения экспозиции. Ингибирующий эф- -фект давления усиливался также с поднятием температуры. Жиз-

89