книги из ГПНТБ / Крисс А.Е. Жизненные процессы и гидростатическое давление

Вдругой серии экспериментов, где применяли давление 5000 атм

втечение 30 мин., антиген Н был полностью инактивирован,

судя по отсутствию антител в сыворотке кроликов через месяц после начала иммунизации их суспензией бактерий, пробывших под этим давлением. В контроле агглютинациоиный титр сыворот­ ки был относительно высоким. Что же касается антигена О, то он дал одинаковый и самый высокий титр агглютининов в сыво­ ротках, полученных от иммунизации животных суспензией бак­ терий из-под давления и нагретой вакциной. С антигеном Ѵі были достигнуты в этой серии те же результаты, что и в опы­ тах с давлением 1500 атм — значительно больший титр, чем в контроле (табл. 4).

Сравнительная устойчивость антигена Уі привела Vignais, Lecomte et Macheboeuf (1953) к дополнительным опытам. Сус­ пензию клеток Salmonella paratyphi С помещали под давле­ ние 300 атм на 5 мин. После снятия давления бактерии перено­ сили в бульон, где они размножались в условиях атмосферного давления, а оттуда — на твердую питательную среду для получе­ ния колоний. Из колоний готовили суспензию бактерий, которая в свою очередь подвергалась давлению 3000 атм в течение 5 мин. Из этой суспензии вновь получали культуру бактерий, их поме­ щали под давление, и такая процедура повторялась многократ­ но. Авторы сообщают, что с каждым пассажем при указанном давлении антиген Ѵі становился все слабее, что выражалось в уменьшении агглютинирующей силы сыворотки к нему. Пассажи при одной атмосфере в какой-то мере восстанавливали антиген Ѵі, но это восстановление происходило полнее, например, после седьмого пассажа через высокое давление, чем после десятого.

Изменения антигена Ѵі в бактериальных клетках были оди­ наковыми во всех колониях, выросших из каждого пересева. Бо­ лее того, исследования отдельных участков колоний убедили ав­ торов в том, что внутри колонии диссоциация ио антигенным свойствам бактерий ие происходила.

ТЕПЛОВАЯ ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКА ПОД ВЫСОКИМ ДАВЛЕНИЕМ

При одновременном действии на белок нагревания и высокого давления в определенных пределах наблюдается задерживающее тепловую денатурацию влияние высокого давления.

Количественные определения показали (Johnson, Campbell, 1946), что раствор сывороточного глобулина, нагревавшийся в течение двух часов при температуре 65° и высоком давлении, противостоял денатурирующему действию температуры значитель­ но лучше, чем при атмосферном давлении. В то время как при одной атмосфере в конце опыта в растворе оставалось только около 25% белка, под давлением 7500 ф/д2 примерно такой же

20

процент характеризовал количество выпавшего в осадок глобули­ на; остальная пасть сохранялась в растворенном состоянии '.

Эффект тепловой денатурации белка повышался при более низком давлении — 5000, 3000, 1500 ф/д2(рис. 9).

Обращает на себя внимание почти полная задержка процесса тепловой денатурации раствора глобулина под давлением 7500 ф/д2. При меньших давлениях оиа отсутствовала, наблюда­ лось лишь замедление скорости выпадения коагулята в этот пе­ риод времени. Авторы объясняют даниое явление двумя возмож­ ными причинами — гетерогенностью белковых молекул или (и) сложностью реакций у гомогенных молекул. Величина эффекта давления указывает на то, что увеличение объема в денатурационном процессе составляет 100 мл на моль белка.

Задерживающее действие высокого давления наблюдалось и в опытах, когда на сывороточный глобулин одновременно дейст­ вовали два денатурирующих агента — температура и алкоголь. Прибавление этилового спирта повышало скорость денатурации, однако давление 10000 ф/д2 заметно ингибировало процесс пре­ ципитации белка, вызванный совместным действием этих агентов. Под высоким давлением, через два часа нагревания при 65° и концентрации 0,3 М алкоголя в растворе белка, коагулировало око­ ло 50% глобулина, между тем как в этих же условиях при одной атмосфере в растворе оставалось только около 20% белка (рис. 10).

Явное ингибирующее влияние высокого давления на тепловую инактивацию антитоксина к стафилококковому гемолизину было также прослежено Johnson a. Wright (1946). Антитоксин нагре­ вался в течение 48 час. при 65° и атмосферном давлении (конт­ роль) и под давлением 10000 ф/д2, в этих сравнительных опы­ тах менялись также значения pH антитоксической сыворотки: они составляли 4,82; 6,65; 8,50. Уже в первые часы нагревания наблюдалось замедление процесса инактивации антитокспна под действием высокого давления, особенно заметное при pH 8,50. К концу опытов этой серии антитоксическая активность гретой сыворотки под давлением 10000 ф/д2 была почти вдвое выше, чем у сыворотки, испытавшей температурное воздействие при атмосферном давлении (рис. 11).

Ингибирование процесса тепловой денатурации белка при на­ гревании его под высоким давлением описывает также Тонгур (1948, 1949). Как видно из табл. 5, количество растворимого белка при нагревании яичного белка (61; 61,5°) под давлением 850, 1700 и 3000 атм не изменялось по сравнению с исходным белком. Между тем такое же нагревание в условиях атмосфер­ ного давления приводило к коагуляции 16—23% белка. Для объ­ яснения этого явления автор выдвинул предположение, что, по­ скольку давление усиливает процессы, идущие с уменьшением

1 Давление 14,7 фунта на 1 кв. дюйм (ф/q2) равно одной атмосфере.

21

объема, а денатурация белка приводит к увеличению объема, следует ожидать тормозящее влияние давления на коагуляцию белка при нагревании.

С повышением давления более 3000 атм не только не наблю­ далось ингибирующее действие высокого давления на тепловую денатурацию белка, но даже происходило усиление процесса вы­ падения белка из раствора. Под давлением 6800 атм количество растворимого белка уменьшалось на 50% (табл. 5). Здесь к теп­ ловой денатурации прибавлялся денатурирующий эффект воздей­ ствия на белок сверхвысокого давления.

8000 атм той же продолжительности. Однако при 70° давление до 2000—3000 атм задерживало тепловую денатурацию глобули­ на, и только свыше 3000 атм ускорялся процесс преципитации белка, он целиком оказывался в осадке после пятиминутного дей­ ствия давления 6000 атм.

РЕНАТУРАЦИЯ ДЕНАТУРИРОВАННОГО НАГРЕВАНИЕМ БЕЛКА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ВЫСОКОГО ДАВЛЕНИЯ

В своем обзоре Тонгур (1951) приводит литературу об обра­ тимости денатурации сывороточного альбумина, псевдоглобулина, тироглобулина, ß-лактоглобулина, целого ряда ферментов, денату­ рированных теплом, мочевиной, кислотами и другими агентами. Ренатурация достигалась удалением денатурирующего агента и изменением pH. Были восстановлены растворимость, биологиче­ ская активность, способность к кристаллизации и другие свой­ ства. Новое в этой области — открытие способности высокого

23

давления репатурпровать белок, денатурированный нагреванием. Johnson a. Campbell (1946) обратили внимание на уменьше­ ние количества преципитата белка, образовавшегося после нагре­ вания раствора сывороточного глобулина в течение 20 мин; при 65° и атмосферном давлении, когда этот раствор затем помещали под давление 10 000 ф/д2 на длительный срок (табл. 6). Как еи д н о из таблицы, процент флокулированного белка почти не из­ менился через 65 час. пребывания при атмосферном давлении раствора сывороточного глобулина, подвергавшегося тепловой де­ натурации в присутствии или в отсутствии алкоголя. Однако за этот срок под давлением 10000 ф/д2 количество флокулята уменьшилось на 31% за счет перехода его части в раствор, не­ содержащий алкоголя. Растворимость белка, денатурированногосовместным действием нагревания и алкоголя, восстанавливалась

24

Более детально явление ренатурации высоким давлении бел­ ка, подвергавшегося тепловой денатурации, исследовали Тонгур и сотр. (1948, 1949, 1950, 1954).

Первые опыты проводили (Тонгур, 1948, 1949) с яичным бел­ ком. Его нагревали при 62°, а затем ставили под давление 2000 и 3000 атм. Денатурирующий эффект нагревания выражался в выпадении из раствора 18% белка, но образовавшийся коагулят переходил в раствор полностью или почти полностью под ука­ занным давлением в течение нескольких часов.

Иммунологические свойства нативного, денатурированного и ренатурированного сывороточного альбумина (Тонгур, Касаточкин, 1954) показаны ниже.

Дальнейшее изучение ренатурированного давлением яичного бел­ ка после тепловой денатурации его показало (Тонгур, Казьмина, 1950), что помимо растворимости в значительной мере восстанав­ ливаются такие свойства, как вязкость и неревариваемость трип­ сином.

Аналогичные результаты были получены с кристаллическим сывороточным альбумином. Ренатурированный белок по раствори­ мости, вязкости, углу вращения плоскости поляризации, степени и скорости перевариваемости трипсином резко отличался от дена­ турированного сывороточного альбумина, приближаясь по этим свойствам к исходному белку. Реиатурация сывороточного аль­ бумина, в отличие от яичного белка, происходила даже в том случае, когда альбумин помещали под давление спустя продол­ жительное время после тепловой денатурации.

Интересно то обстоятельство, что ренатурированный белок, подвергнутый повторной коагуляции нагреванием, вновь восста­ навливал свою растворимость под давлением, однако некоторая часть его денатурировалась необратимо (рис. 12).

Дальнейшее определение свойств ренатурированного сыворо­ точного альбумина показало, что давление восстанавливает его антигенную специфичность и активность. В сравнительных опы­ тах по преципитации с сыворотками, полученными от иммуниза­ ции нативным, денатурированным и ренатурированный белками, выяснилось, что максимальные разведения иммунных сывороток, при которых еще наблюдалась преципитация с нативным и ренатурированным белками, совпадали (см. выше).

25

Привлекает внимание тот факт, что давление ие способно ренатурировать сывороточный альбумин после денатурации его светом и мочевиной: очевидно, действие этих факторов отлично от денатурирующего действия нагрева.

Ренатурация под давлением была достигнута не только в опы­ тах с яичным белком и сывороточным альбумином, но и в опы­ тах с кональбумином, овальбумином, ^-глобулином, химотрипсином и инсулином. Тонгур и Касаточкин (1954) отмечают, что

давление способствует ускоренному и более полному по сравне­ нию со спонтанной ренатурацией восстановлению активности у денатурированного теплом химотрипсииа. Что же касается инсу­ лина, то регенерация его активности давлением после денатура­ ции происходила и в том случае, когда давление не приводило к исходной вязкости раствора этого фермента.

Не только животные, но и растительные белки можно рена­ турировать высоким давлением после тепловой денатурации (Орло­ ва и др., 1954). В опытах с глиадином, белком, содержащимся в семенах злаков, денатурированный нагреванием при различных температурах белок восстанавливал растворимость в результате пребывания под давлением 2000 атм в течение 20 мин., но не полностью. По этому свойству регенерированный глиадин занимал промежуточное место между нативным и коагулированным белком.

По другим признакам ренатурированный белок отличался так­ же от денатурированного и исходного: по вязкости, углу враще­ ния плоскости поляризации и перевариваемости трипсином. Наи­ меньшие различия с нативным белком и наибольшие с денатури­ рованным у регенерированного глиадина были по углу вращения плоскости поляризации, затем — перевариваемости и на послед­ нем месте — по вязкости.

Авторы указывают, что с повышением температуры нагрева­ ния и увеличением его продолжительности резко возрастала сте­ пень денатурации глиадина, а также усиливалась регенерируе­ мость этого белка под действием высокого давления, но в меньшей степени.

Ренатурация 'ісгаюіэулина, денатурированного нагреванием при 70° в течение 5 мин. и атмосферном давлении или давле­ нием 5000, 5500 атм, продолжительностью 5 мин. при 30°, была

26

достигнута Suzuki К. a. Miyosawa (1965). Денатурированный нагреванием глобулин не изменился при атмосферном давлении и температуре 3 и 30° в течение 60 час. опыта. Лишь под дав­ лением 800 атм и 30° наблюдалось примерно через трое суток снижение процента коагулированного белка наполовину.

В опытах с белком, коагулированным высоким давлением, уже через час после применения давления 800 атм при 30° про­ цент коагулированного альбумина снизился с 68 до 9,3. В усло­ виях атмосферного давления ренатурация не происходила даже через сутки, если температура была 3°; при 30° и 1 атм часть коагулята перешла в растворимое состояние (табл. 8). Повыше­ ние давления с 800 до 1200 атм для ренатурации глобулина,

Т а б л и ц а 8. Ренатурация т-глобулина, депатурпрованного высоким давлением и нагреванием (Suzuki К., Miyosawa, Шй)

преципитированного давлением 5500 атм, ускорило процесс пере­ хода преципитата в раствор. Примечательно, что в опытах с более высоким содержанием коагулята (85 и 100 %) в результате при­ менения давления 6000 и 8000 атм соответственно ренатурация в первом случае была невелика, а в последнем — совсем отсутст­ вовала. Имела значение также температура, при которой происхо­ дила ренатурация: скорость ренатурации возрастала с повышением температуры с 20 до 40°. Авторы отмечают некоторые различия

новили, что с повышением давления от 2000 до 14 000 атм усили­ ваются процессы полимеризации нуклеиновых кислот. Давление

27

2000 атм приводило к заметному уменьшению количества высо­ ких полимеров по сравнению со средними. При большем давле­ нии наблюдалось нарастание главным образом высокомолекуляр­ ных полимеров; под давлением 14 000 атм содержание их воз­ растало в 2—5 раз по сравнению с контролем (табл. 9). Между тем это давление лишь незначительно увеличивало концентрацию средних полимеров. Образовавшиеся высокомолекулярные поли­ меры оказались малоустойчивыми, они довольно быстро исчезали после снижения давления до одной атмосферы.

В присутствии деполимеразы процесс деполимеризации про­ текал очень быстро после снятия давления 6000 атм. Результаты данной серии экспериментов, как указывают авторы, зависели от соотношения субстрата и фермента. При отсутствии фермента или малом количестве его наблюдалась полимеризация РНК, при равных количествах фермента и субстрата ни полимеризация, ни деполимеризация нуклеиновой кислоты не происходили, а зна­ чительный сдвиг в соотношении РНК и деполимеразы в пользу фермента вызывал, наряду с деполимеризацией, образование нестабильных полимеров. Эти данные интерпретируются как ре­ зультат взаимодействия следующих факторов: стимулирующего влияния высокого давления на процесс полимеризации, ингиби­ рующего действия высокого давления на активность фермента и возбуждение его после снятия давления полимерами, возникшими под высоким давлением.

Последующие опыты установили, что высокомолекулярные по­ лимеры, возникшие в растворе РНК и рибонуклеазы под давле­ нием 6000 и 14 000 атм, гидролизовались после снятия давления в меньшей степени, чем во фракции, которая находилась при атмосферном давлении. Рибонуклеаза вне субстрата оказалась устойчивой к давлению 12000 атм, поэтому авторы объясняют

28

более слабый гидролиз РНК после высокого давления образова­ нием под давлением в процессе полимеризации новых связей, относительно стабильных и резистентных к рибоиуклеазе. Пред­ полагается, что эти новые связи возникают за счет кислых групп

30 мин, пребывания под давлением 10000 атм и комнатной тем­ пературе и расплавляется под давлением 2700 атм при более высокой температуре, чем в условиях атмосферного давления. Как видно из рис. 13, высокое давление повышало температуру плавления ДНК иа несколько градусов, соответственно сдвигая границу термальной инактивации ДНК. Даже более низкое, чем 2700 атм, давление оказывало аналогичное влияние: при 100° заметный порог наблюдался между 1600 и 2000 атм (рис. 14). Оптимальная температура для ренатурации ДНК была примерно па 25° ниже температуры денатурации. Давление 2700 атм по сравнению с атмосферным заметно ингибировало процесс ренату­ рации.

Авторы приводят также результаты изучения защитного дей­ ствия высокого давления во времени (рис. 15). Heden (1964) считает, что медленное снижение биологической активности ДНК при 100° и давлении 2700 атм иллюстрирует процесс гидролити­ ческого расщепления пуриновых оснований, и предполагает воз­ можность мутагенного эффекта высокого давления в тех пределах величии, которые применялись в его экспериментах. Однако Holme a. Edebo (1960) не удалось наблюдать такого эффекта, применяя давление 2000 и 3000 атм в течение 30 сек. или дав­ ление от 150 до 700 атм с более продолжительным периодом его действия.

Устойчивость ДНК к высокому давленшо была продемонстри­ рована также Suzuki К., Miyosawa, Tsuchiya a. Taniguchi (1968). В их опытах дезоксирибонуклеиновые кислоты из спермы лосося и зобной железы теленка выдерживали давление 10000атм в течение часа при температуре 25—40° без изменений оптиче­ ской плотности при 260 ммк.

ДНК зобной железы теленка через час после пребывания под давлением 9000 атм не отличалась по оптической плотности при 260 ммк от контроля (Suzuki К. et ab, 1971). С повышением давления уменьшалась тепловая денатурация ДНК. Свыше 3000 атм она достигала постоянной величины 16%, когда ДНК нагревали 30 мии. при температуре 71,5°. Под давлением выше 4000 атм нагрев при 74,5 и 77,5° приводил к величинам денатурации соот­ ветственно 27 и 53% (рис. 16).

29