книги из ГПНТБ / Крисс А.Е. Жизненные процессы и гидростатическое давление

Рис. 13. Остаточная трансформирующая активность ДНК поело нагревания (30 мин.) при разных температурах под давлением 1 и 2700 атм (Hedén, 1964)

Рис. 15. Остаточная трансформирующая активность ДИК (по индолу) после нагревания с различной продолжительностью при 100° под давле­ нием 1 (1) и 2700 (2) атм (Hedén, 1964)

Рис. 16. Влияние давления на тепловую денатурацию ДНК (Suzuki К. et al., 1971)

J — 71,5“; 2 — 74,5°; 3 — 77,5°

ВЛИЯНИЕ НА СИНТЕЗ БЕЛКА И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

В опытах Pollard a. Weller (1966) с Escherichia coli был изучен процесс включения пролина и валина в состав белка, тимина — в состав ДНК и урацила — в состав РНК под различным давлением.

Как видно, давление 900 атм полностью прекращало включение тимина и сравнительно мало влияло на включение пролина, вали­ на и, особенно, урацила. После снятия давления процесс восста­ новления до нормы следовал за некоторым латентным периодом, составлявшим около 10 мин. в опытах с давлением 900 атм.

Landau (1966а) более подробно исследовал процесс включе­ ния под давлением лейцина и глицина в состав белков, а адени­ на в нуклеиновые кислоты Escherichia coli. При 6000 ф/д2 и 37° включение глицина шло с такой же скоростью, как при атмо­ сферном давлении, и в конце опыта содержание этой аминокисло­ ты в бактериальном белке было одинаковым при этих величинах давления. Давление 8000 и 10 000 ф/д2 оказывало ингибирующее действие, а 4000 ф/д2 — явно стимулирующий эффект на вклю­ чение глицина (рис. 17). Аналогичные результаты были получены с лейцином и аденином.

Температура влияла на процессы синтеза белка и нуклеино­ вых кислот под высоким давлением. Под давлением 4000 ф/д2 температура 27° стимулировала процесс включения лейцина в белок, а ниже 27°, наоборот, оказывала ингибирующее действие.

Снятие давления 10 000 ф/д2, после того как оно полностью ингибировало процесс включения в белок глицина, приводило к почти мгновенному восстановлению этого процесса (рис. 18).

Кинетику процесса синтеза ДНК, РНК и белка под давлением в клетках Е. coli изучали Yayanos а. Pollard (1969). Опре­ делялась скорость включения тимина, урацила и лейцина в зави­ симости от величины давления, его продолжительности и темпе­ ратуры. Под давлением около 250 атм и 37° скорость включе­ ния тимина возрастала с увеличением экспозиции, однако она была меньше, чем при одной атмосфере. При той же температуре в

31

Рис. 18. Включение глицина-С11 в белок после снятия ингибирующего этот процесс давления 10 000 ф/д2 (Landau, 1966а)

J — давление 15 ф/д2; 2 — 10 000 ф/д2; стрелки означают, что давление снято

пределах давления от 500 до 800 атм наблюдалось небольшое повышение кривой в начальный отрезок времени, а затем уже содержание тимина в клетках не возрастало. Более высокое дав­ ление (865 и 946 атм) препятствовало включению тимина. Деком­ прессия после пребывания бактерий под давлением в течение 2—3 час. приводила к восстановлению их способности включать тимин в ДНК со скоростью, сравнимой с той, которая наблюда­ лась в бактериальной культуре, развивавшейся в условиях атмо­ сферного давления.

Аналогичные результаты были получены в опытах с урацилом и лейцином; с повышением давления скорость уменьшалась и падала до нуля для урацила под давлением 770 атм, а для лей­ цина — 580 атм. Таким образом, авторы подтвердили данные ZoBell а. Cobet (1964) и Pollard a. Weller (1966) о том, что синтез РНК может продолжаться под давлением, которое ингибирует процессы синтеза белка и ДНК.

Синтез белка, РНК и ДНК в условиях повышенного гидроста­ тического давления исследовали Albright a. Morita (1968). Объектом служила выделенная с глубины 1200 м психрофильная бактерия Vibrio marinus, у которой максимальными пределами для размножения были температура 20° (оптимальная — 15— 16°) и давление 425 атм.

Под давлением 200 атм скорость синтеза белка и РНК не­ сколько снизилась, но через час она сравнялась со скоростью

32

в контроле при атмосферном давлении; синтез ДНК с самого начала опыта шел с той же скоростью, что при 1 атм. Эта картина изменилась с повышением давления до 400 атм: умень­ шилась скорость синтеза белка и ДНК, тогда как скорость синте­ за РНК не отличалась от контроля. Авторы указывают, что ин­ терпретация этого явления затруднительна.

Увеличение давления до 500 атм привело к падению скорости синтеза белка на 75%, между тем синтез РНК и ДНК протекал 30 и 50 мин. соответственно скорости в контроле и только затем начал уменьшаться. Давление 1000 атм полностью ингибиро­ вало синтез белка и ДНК; синтез РНК продолжался короткое время.

Albright (1969) изучал характер изменений в синтезе белка, РНК и ДНК в клетках Escherichia coli и Vibrio marinus, когда в экспоненциальной фазе их роста давление поднималось до 544 атм, затем опускалось до 1 атм и вповь поднималось до 544 атм.

При первом подъеме давления наблюдалось почта немедлен­ ное падение синтеза белка у Е. coli и Vibrio marinus. Синтез РНК снизился у Е. coli и прекратился у V. marinus. Через несколько минут синтез белка и РНК восстановился у Е. coli, но с меньшей скоростью. Клетки V. marinus пе проявили такой адаптации во время первого повышения давления до 544 атм.

Снятие давления привело у обоих видов к возобновлению син­ теза белка и РНК по экспоненциальной кривой, и он продол­ жался также при втором подъеме давления до 544. атм, но ско­ рость его уменьшилась (рис. 19).

Синтез ДНК не прекращался во время первого подъема давле­ ния, но этот процесс стал постепенно замедляться и после второго

повышения остановился. Таким образом, по чувствительности к высокому давлению процессы синтеза у исследованных компо­ нентов бактериальных клеток располагались в следующем поряд­ ке: белок > РНК > ДНК.

Давление 670 атм не препятствовало проникновению в клетки Е. coli С14-амииокпслот, включению их в полисомы и образо­ ванию транспортной лейцил-РНК из С14-лейщша (Schwarz, Landau, 1972). Однако меченные С14аминокислоты не обнару­ живались в полисомах, если бактериальные клетки до прибавле­ ния аминокислот были подвергнуты давлению.

Zimmerman (1962, 1963) в своих опытах стремился выяснить, происходил лп синтез ДНК в клетках морского ежа Arbacia punctulata, деление которых было блокировано высоким давле­ нием. Он помещал оплодотворенные яйца в растворе Н3-тпмидшіа под давлением 5000 ф/д2 на 30 и 60 мни. В первой серии авторадиограммы показали, что меченый тимидин включается в хромосомальиую ДНК, если давление применялось вскоре после обсеменения яиц. В тех случаях, когда давление поднимали в на­ чале стадии профазы или метафазы, Н3-тимидпн не обнаружи­ вался в ДНК хромосом.

Удлинение экспозиции под давлением до 60 мин. приводило к тому, что включение меченого тимидина происходило также на стадиях профазы и метафазы. В этой серии опытов зернис­ тость, дающая авторадиографический эффект, сосредоточивалась не только в виде одной массы, но часто также в виде двух масс. Автор допускает, что с повышением давления образуются две группы хромосом, которые выявляются после включения Н3-тимидина.

Авторадиографические зерна в контроле насчитывались в боль­ шем числе, чем в япцах, подвергавшихся давлению. Различие наблюдалось независимо от того, на какой стадии применялось давление — профазы или метафазы.

Включение Н3-тимидппа в ДНК происходило при наличии или отсутствии неповрежденной ядерной оболочки. Более того, включение его наблюдалось в яйцах, в которых давление препят­ ствовало образованию митотического аппарата или дезорганизова­ ло уже существующий аппарат митоза.

что давление, превышающее 7500 ф/д2, препятствует включению Н3-тимидииа в оплодотворенные яйца морского ежа. Авторы от­ мечают, что блокирование синтеза ДНК после давления 7500 ф/д2 в течение часа не разрушало целостности клеток. Примерно по­ ловина их продолжала дробление после снятия давления, однако процесс дробления и последующее развитие отклонялись от нор­ мы и не завершались.

Дальнейшие исследования с мечеными уридином и фенил­ аланином были проведены для суждения о влиянии давления иа

34

Клетки инкубировались с 14С-феннлаланином (а) или “Н-уридином (б) в течение 10 мин. и находились при атмосферном давлении (1), предварительно подвергались тепловому шоку и через 15 мин. давлению 10 000 ф/дг в течение 2 мин. (2), через 25 мин. после те­ плового шока подвергались давлению 10 000 ф/д2 в течение 2 мин. (3)

Рис. 21. Изменения оптической активности раствора дезоксирибонуклеино­ вой кислоты при разных величинах температуры н давления (Weida, Gill, 1966)

1 — атмосферное давление; г — давление 10 000 ф/д2; з — давление 20 000 ф/д3

синтез РНК и белка у Tetrahymena pyriformis (Zimmerman, 1969). Через 15 и 25 мин. после теплового шока клетки поме­ щали под давлением 10000 ф/д2на 2 мин. и затем инкубирова­ ли 10 мин. в растворах радиоактивного уридина или фенилала­ нина. Как видно на рис. 20, способность Tetrahymena включать уридин и фениланин после давления 10000 ф/д2 снижалась и заметно уменьшалась скорость процесса по сравнению с конт­ ролем при атмосферном давлении. Такая же картина наблюдалась

количество полисом уменьшалось по сравнению с контролем. Одиако когда клетки подвергались этому давлению на 45-й мину­ те после теплового шока, т. е. за 15 мин. до образования новых полисом, то после декомпрессии, на 60-й минуте количество их не отличалось от контроля. По-видимому, давление не оказывает влияния на индивидуальные компоненты полисомы (информа­

2* 35

ционная РНК и рибосомы), тогда как сама полисома не отли­ вается устойчивостью к давлению.

Высокие температуры и высокое гидростатическое давление, задерживающие клеточное деление, ингибируют процесс включе­ ния Н3-уридина в клетки Tetrahymena pyriformis (Yuyama, Zimmerman, 1969). Но в то время как повышенная температура подавляет синтез высокомолекулярных фракций РНК, давление

а в четырех соединяли с неповрежденными Blepharisma, непо­ средственно перед повышением давления до 3000—4000 ф/д2. Через 3 часа после снятия давления во всех сериях процент клеток с заметной меткой составлял в контроле 83,8 ±18,0 и 66,5 в клетках, пробывших 3 часа под давлением 4000 ф/д2. Аналогичная картина наблюдалась в опытах, которые проводили под давлением 3000 ф/д2. Поскольку регенерация Blepharisma прекращалась под давлением 3000 ф/д2, автор заключает, что какое-то другое обстоятельство, а не скорость синтеза РНК, является основным в регенерации Blepharisma.

рибоадениловой — полирибоуридиловой кислот. Переход спираль­ ной структуры в кольцевидно свернутую оценивался на основании измерения оптического вращения и спектра поглощения в уль­ трафиолетовой области спектра. Было найдено, что изменения объема при этом переходе были невелики и отрицательны и ука­ зывали на стабилизацию кольцевидной структуры под давлением.

Gill a. Glodowsky (1965) наблюдали влияние температуры на развертывание рибонуклеазы и поли-,у-беизил-Ь-глутамата в условиях высокого давления. Они отметили усиление этого про­ цесса с увеличением давления до 1400 атм.

температуры, для того чтобы достичь такого же эффекта в раз­ вертывании дезоксирибонуклеиновой кислоты, как при атмосфер­ ном давлении (рис. 21).

Suzuki К. a. Taniguchi (1967) измеряли проводимость вод­ ных растворов натриевой соли поли-й-глутаминовой кислоты под высоким давлением. Независимо от концентрации этой соли мак­ симум проводимости был отмечен под давлением 3600 атм, что может быть объяснено минимальной вязкостью воды при этом

36

ВИРУСЫ И ВЫСОКОЕ ДАВЛЕНИЕ

Почти все исследования в этой области ставили своей целью выяснить чувствительность к высокому давлению вирусов бакте­ рий, актиномидетов, растений, животных и человека, а также перевиваемых агентов, вызывающих опухолевые заболевания у животных.

ДЕЙСТВИЕ НА ВИРУСЫ БАКТЕРИЙ Б АКТИНОМИЦЕТОВ

Инактивация

Устойчивость к высокому давлению стафилококкового, тифоз­ ного бактериофагов и фага к сенной палочке изучалась Basset, Wollman, Macheboeuf et Bardach (1933). Наиболее чувстви­ тельным оказался стафилококковый фаг. Он инактивировался полностью через 45 мин. под давлением 1000 атм, хотя исходная концентрация его составляла 10® и 10® в 1 мл. Заслуживает внимания тот факт, что хозяин этого фага — стафилококк не погибал после давления 5000 и 6000 атм, между тем как к дру­ гим физическим, а также химическим агентам он оказывался менее устойчивым, чем бактериофаг к нему.

Фаги к тифозной и сенной палочкам выдерживали более высо­ кое давление: при той же экспозиции они сохраняли большую часть своей активности после давления 2000 и 4500 атм. Даже давление 7500 атм не вызывало полного разрушения фага к Bacillus subtilis.

В смеси с клетками хозяина бактериофаги переносили более высокое давление. Стафилококковый фаг проявлял литическое действие через 2 часа пребывания в смеси со стафилококками под давлением 3000 атм и через 45 мин. под давлением 4500 атм. Опыты с тифозным бактериофагом показали, что титр 101сохра­ нился у него после того, как он находился вместе с чувстви­ тельной к нему культурой тифозной палочки под давлением 7000 атм в течение 45 мин.

Еще большую устойчивость проявил фаг Bacillus subtilis.

38

когда его смешивали со спорами этой бактерии и помещали под давление 10 000—13 500 атм на 45 мии.: он сохранил способность к лизису бактерий и размножению (Basset, Wollman Е., Wollman É., Macheboeuf, 1935).

Эти же авторы установили, что споры лизогенной культуры Bacillus megaterium, находившиеся под давлением 9500— 10000 атм, после снятия давления и проращивания давали лизо­ генные культуры этой спороносной палочки. Таким образом, ли­ зогенная способность Вас. megaterium не исчезала под давле­ нием, которое превышало давление (6500—7000 атм), приводящее к инактивации фага, порождаемого дайной бактерией.

Степень влияния высокого давления на размножение бактерио­ фага зависела от того, насколько длительным было его приложе­ ние в период взаимодействия фага с клетками хозяина (Foster, Johnson, 1951). Давление 7000—9000 ф/д2 препятствовало вос­ произведению фагов Т2, Т5, Тб, Т7, если оно вводилось в латент­

В опытах, когда давление снималось вскоре после окончания латентного периода, титр увеличивался после некоторого интерва­ ла, величина которого зависела от типа фага. Урожай был тем меньше, чем больше времени проходило до снятия давления (рис. 22). При большой продолжительности давления могло на­ ступить снижение первоначального титра фага.

По данным Rutberg (1964), имеется заметное различие в чувствительности бактериофагов Т2, Т4, Т5 к высокому давле-

Рис. 22. Изменение титра бактериофага Т7 после снятия давления 9000 ф/д2, приложенного через 7,5 мин. после инфекции Escherichia coli (Foster, Johnson, 1951)

1 — контроль; 2 — давление снято после инфекции через 22 мин.; з — через 30 мин.; d — через 45 мин.

Рис. 23. Инактивация бактериофагов Т2 (1), Т4 (2), Т5 (3) при различных величинах давления продолжительностью 5 мин. (Rutberg, 1964)

39