книги из ГПНТБ / Крисс А.Е. Жизненные процессы и гидростатическое давление

из них видно, что при этом давлении через 12 час. была вос-т становлена лишь Vs количества нитратов, редуцированных в ус­ ловиях атмосферного давления. С удлинением времени инкубации до 48 час. под давлением заметно возрастала концентрация в среде нитритов в опыте с Pseudomonas perfectomarinus.

Инактивирующее влияние давления на денитрифицирующую способность отмытых клеток Ps. perfectomarinus оказалось силь­ нее при низких температурах. Как видно на рис. 35, восстановле­ ние нитратов под давлением 1000 атм происходило при 2° слабее,

NO2— N, мкг/мл

* Восстановлено все количество нитратов.

60

чем при более высоких температурах. Последействие давления на отмытые клетки этого вида также зависело от температуры, при которой производилась компрессия. После пребывания клеток под давлением 1800 атм в течение 24 час. и температурах 10, 21, 30 и 40° нитратредуцирующая активность их была наибольшей в опыте при 40° и наименьшей — при 10°.

Авторы заключают, что их исследования показывают возмож­ ность восстановления нитратов на любой глубине океана, причем этот процесс может происходить под давлением, уже лимитирую­ щем размножение бактерий.

ТРАНСФЕРАЗЫ

Р Н К а з а

Vignais et Macbeboeuf (1954a, b) установили, что в полпдисперсиом растворе дрожжевой рибонуклеиновой кислоты под дав­ лением 2000—6000 атм ферментативный гидролиз средних поли­ меров протекал, как и при атмосферном давлении, но подавлялся в отношении высоких полимеров. При 2000 атм наблюдалось даже активирование рибонуклеазы. Свыше 6000 атм гидролиз средних

Рис. 36. Влияние давления (в атм) на скорость тепловой агрегации поли-Ь-валилрибо- иуклеазы(КеишаиеІ al., 1966)

1 — Іатм;

2 — 150;

3—300;

стрелки означают, что давление снято

и высоких полимеров уже прекращался. Давление 14 000 атм способствовало увеличению высоких полимеров, но это явление наблюдалось и в отсутствие фермента.

Авторы отметили, что в системе рибонуклеиновая кислота — рибонуклеаза под высоким давлением не происходило смещения равновесия в сторону синтеза.

Активность РНКазы из поджелудочной железы быка повы­ шалась под давлением 7100, 14 200 и 21300 ф/д2 (Murakami,

61

живался под давлением 150 и 300 атм. На рис. 36 видно, что скорость помутнения раствора фермента была наибольшей при одной атмосфере и заметно уменьшалась с увеличением давле­ ния. После снятия давления кривая нарастания мутности стано­ вилась похожей на кривую термальной агрегации в условиях атмосферного давления.

Oliveira а. Westort (1970). Денатурация фермента обратимой в этих условиях оказалась на 100%, когда применяли малые кон­ центрации белка.

жира панкреатическим соком замедлялся в условиях давления 500, 1000, 1500 атм продолжительностью 15—45 мин.

Фосфатаза. Влияние температуры

Фосфатазная активность у бактерий под давлением исследо­ валась Morita a. Howe (1957). Для определения ее применяли ?г-нитрофеиплфосфат — бесцветное соединение, переходившее под действием фосфатазы в н-нитрофенол, имеющий желтую окраску в щелочной среде. Из испытанных морских бактерий семь видов были выделены из шельфовой зоны Тихого океана, а два штамма и смешанная культура получены с больших глубин.

Как видно из табл. 19, фосфатазная активность большинства бактерий значительно варьировала в зависимости от видовой при­ надлежности и величины давления. У Micrococcus aquivivus, М. euryhalis и Pseudomonas xanthochrus она была примерно оди­ наковой под давлением 1, 200, 600 и 1000 атм продолжительно­ стью один час.

■В опытах с Flavobacterium raariuotypicum и Pseudomonas perfectomarinus наблюдалось усиление фосфатазной активности при 200 атм по сравнению с активностью при 1 атм; затем она по­ следовательно снижалась под давлением 600 и 1000 атм у F. інаrinotypicuHi, тогда как у Ps. perfectomarinus она была несколько выше при 1000, чем при 600 атм.

62

Для штаммов, выделенных с больших глубин, характерным оказалось возрастание фосфатазной активности с увеличением давления.

Активность фосфатазы, экстрагированной нз мелководного пла, не снижалась под давлением 1000 атм (ZoBell, Kim, 1972). После 15-минутиого пребывания фермента под этим давлешшм при 25°

*Выделены из красной глины на глубине 4712 м.

**Выделены на глубине 3935 м из глины.

его активность оставалась такой же, как в условиях атмосфер­ ного давления. Авторы также отмечают, что фосфатазы, выделен­ ные из штаммов двух глубоководных бактерий, были значитель­ но активнее при 1000 атм, чем при 1 атм.

Фруктозодифосфатаза

Сопоставление чувствительности к давлению до 20 000 ф/д2 фруктозодифосфатазы, выделенной из печени бентосной рыбы Соryphaenoides acrolepsis, и рыбы, живущей в поверхностных водах, PimeloBietopon pulchrum, выявило различия в их баротолерант-

ратуры до 9° способствовало усилению барорезистентности фрук­ тозодифосфатазы. Данный фермент из печени поверхностной рыбы отличался значительно большей чувствительностью к давле­ нию, особенно при низких температурах.

Особенности ферментов фруктозодифосфатазы из печени и пируваткиназы из мышцы у абиссального вида макруруса Coryphaenoides sp., вертикально мигрирующих рыб Ectreposebastes imus,

63

so

Рис. 37. Активность пирофосфатазы при температуре 105° и разных вели­ чинах давления (Morita, Mathemeier, 1964)

1 — 27-минутиый период, необходимый для достижения нужного давления. S — 10-ми­ нутный период

Рис. 38. Действие повышенного давления на активность амилазы при раз­ ных температурах (Schneyer, 1952)

из радужной форели Salmo gairdnerii явились предметом иссле­ дований Hochachka, Moon a. Mustafa (1972). Гидростатическое давление активировало первый фермент, тогда как активность пируваткиназы ингибировалась давлением.

Сходными чертами для фруктозодифосфатазы из разных ис­ точников оказались: ускорение каталитического действия фер­ ментов высоким давлением при pH выше 8, снижение барочув­ ствительности при 15°, резкая потеря активности после действия давления в отсутствие субстрата и Mg2+.

Отличия заключались в том, что фермент из шельфовой рыбы Salmo gairdnerii снижал свою активность под высоким давлением при низком содержании фруктозодифосфата, тогда как фермент из абиссальной рыбы этой особенностью не обладал. Аналогичным образом различались ферменты в отношении кофактора Mg2+. Большая чувствительность к давлению была также у пируваткиназы из радужной форели.

Авторы в этих различиях видят адаптивный характер свойств ферментов, связанный с местообитанием рыб.

Высокое давление ингибирующе действует на инактивацию фосфатазы нагреванием. Это было показано в исследованиях Mo­ rita а. Mathemeier (1964) с неорганической пирофосфатазой из

64

Bacillus stearothermophilus при температуре 90 и 105° и различ­ ных. величинах давления.

Уже давление 100 атм увеличивало активность нагретого до 90° фермента в 25 раз. Еще больший эффект наблюдался под давлением 500—700 атм, которое было оптимальным, поскольку дальнейшее повышение давления приводило к уменьшению ак­ тивности пирофосфатазы. Однако при 1500 атм активность фер­ мента все же была в два раза выше, чем при атмосферном дав­ лении.

Нагрев до 105° при 1 атм полностью инактивировал пиро­ фосфатазу, тогда как активность ее сохранялась почти на одном уровне в ряду величин давления 500—1500 атм; только начиная с 1700 атм, давление уже не препятствовало температурной де­ натурации фермента (рис. 37).

1934), тогда как давление 1500 атм продолжительностью 20 мин. активирующим образом влияло на процесс гидролиза крахмала

экспозиции 3 часа 45 мин.: процент разложенного крахмала был выше, чем в параллельных опытах, в условиях атмосферного давления. Менее отчетливые результаты были получены в опы­ тах со слюной. В одном из восьми опытов под давлением 15UU атм отсутствовало различие с контролем, в двух — давление ингибировало процесс гидролиза крахмала и в пяти опытах про­ цесс активировался.

Амилаза слюны инактивировалась в значительной степени при температуре 60° в условиях атмосферного давления. Однако под давлением 6000 ф/д2 продолжительностью 20 мин. этот темпе­ ратурный режим не препятствовал увеличению активности ами­

war, Macheboeuf et Basset (1954), относительно низкое давление (ниже 2000 атм) при pH 7,0 ускоряло гидролиз крахмала ами­ лазой. Давление свыше 2000 атм снижало скорость фермента­ тивной реакции, полное ингибирование действия амилазы проис­ ходило под давлением порядка 8000 атм.

Авторы указывают, что pH смеси крахмал + амилаза играет важную роль: чем меньше pH, тем ниже величина давления, которая вызывает ускорение реакции гидролиза.. Степень денатуг

рации фермента под высоким давлением также зависит от pH, 100% амилазы инактивировалось в условиях давления 6000 атм

В морской воде при pH 8,2 этот фермент оказался более ус­ тойчивым при атмосферном давлении, чем под давлением 1000атм (ZoBell, Kim, 1972).

Некоторые кинетические аспекты иитактивации а-амилазы As­ pergillus oryzae рассмотрены в работе Miyagawa a. Suzuki (1964).

5 мин. Незначительный эффект наблюдался лишь при более низ­ ких концентрациях энзима, он оказался более устойчивым к инак­ тивирующему действию высокого давления.

Серия опытов была направлена на выяснение зависимости процесса инактивации амилазы от величины давления и темпера­ туры. При 30° инактивация начиналась под давлением 6000 атм и завершалась под давлением 9000 атм. По течению процесса инактивации фермента под высоким давлением во времени выяс­ нилось также, что этот процесс следует кинетической реакции первого порядка.

Инактивация амилазы под давлением реверсибельна. Сопо­ ставление результатов, полученных через 80 мин., после снятия давления 8000 атм, продолжавшегося 5 мин., показало, что реак­ тивация наиболее полно протекала в ряду значений pH от 4,0 до 10,0, при pH 6,0—8,0.

Более подробное изучение процесса восстановления активно­ сти амилазы, денатурированной высоким давлением, было прове­ дено Miyagawa, Saunoe a. Suzuki (1964). Для опытов применялась амилаза, полностью инактивированная в результате действия дав­ ления 9500 атм в течение 10 мин. при 30°.

Ее активность восстанавливалась в условиях атмосферного давления и температуры 30°, так же как под давлением 8000 атм, в зависимости от концентрации фермента: чем выше была кон­ центрация его в пределах от ІО-4 до 10_1%, тем интенсивнее происходила реактивация.

Влияние температуры сказывалось в том отношении, что при одной атмосфере и температуре 40° активность полностью дена­ турированной амилазы не восстанавливалась, между тем как дав­ ление 8000 атм вызывало этот эффект.

Амилаза, частично инактивированная под действием давле­ ния 6000 и 7500 атм, реактивировалась давлением 800 атм: ре­ активация составляла у амилазы, инактивированной давлением 600 атм,— 100%, давлением 7500 атм,— 70% и давлением 9500 атм,— 45 %.

66

Продолжительность действия давления 9500 атм также опре­ деляла эффект реактивации фермента. Десятиминутная экспози­ ция этого давления позволяла еще реактивировать амилазу при атмосферном давлении, если среда имела оптимальный pH (7, 5), но после 60 мин. давления 9500 атм отчетливая реактивация отмечалась лишь при рекомпрессии в условиях 800 атм. при одной атмосфере она отсутствовала.

Примерно сходные данные были получены теми же авторами (Miyagawa et al., 1965) с а-амилазой Bacillus subtilis. Этот фер­ мент полностью инактивировался в течение 5 мин. под давлени­ ем 10 000 атм и температуре 30°. Восстановление его активности не наступало при атмосферном давлении, частичная реактивация наблюдалась под давлением от нескольких сот до 5000 атм; опти­ мальный эффект (восстановление активности около 40%) дости­ гался при рекомпрессии в условиях 3000 атм.

Изменения pH от 4,0 до 9,0 не способствовали реактивации амилазы при атмосферном давлении, однако под давлением 1000 атм этот процесс происходил в зоне, близкой к нейтраль­ ному pH. Отрицательным также был результат воздействия тем­ пературы в ряду от 10 до 50° при атмосферном давлении на ренатурацию энзима, но при повышении давления до 1000 атм активность амилазы восстанавливалась почти до 20%, если, опыт продолжался при 30°.

В условиях атмосферного давления отсутствовала способность фермента восстанавливать активность после компрессии 10000атм независимо от его концентрации в среде. Эта способность выяв­ лялась лишь под давлением 1000 атм, нарастая с повышением концентрации амилазы.

Не столь значительными были различия между степенью ре­ активации частично (под давлением 6500 и 7500 атм) и пол­ ностью инактивированной амилазы (под давлением 10000 атм), когда производилась рекомпрессия в условиях давления 1000 атм. Однако процент восстановленной активности повышался в сериях с меньшей инактивацией фермента.

Зависимость между концентрацией амилазы при pH 6,5; 7,5 и 9,0 и инактивирующим действием давления исследовал Міуаgawa (1966). Чем больше фермента содержалось в растворе, тем выше была степень его инактивации и реактивации.

Рис. 39. Влияние давления (в атм) на амллолитическую активность бакте­ риальных культур (ZoBell, Hittle, 1969)

отмытых клеток объясняется тем, что бактериальные амилазы являются экзоферментами. Обращает на себя внимание способ­ ность выращенных при 1 атм 48-часовых культур, их фильтратов и отмытых клеток гидролизовать крахмал под давлением, при котором они не размножаются (1000 атм), причем не в меньших количествах, чем в условиях атмосферного давления.

Т а б л и ц а 20. Гидролиз крахмала отмытыми клетками бактерий или фильтратами двухсуточных культур (ZoBell, Hittle, 1969)

68

Рис. 40. Влияние давления (в атм) при разных температурах на активность- а-амилазы (ZoBell, Hittle, 1969)

Продолжительность опыта 15 мин.; 1 — 1 атм; 2— 500; 3 — 1000

Рис. 41. Устойчивость а-амнлазы к высокому давлению при разных темпе­

Препарат чистой а-амилазы, подвергнутый давлению 500 и 1000 атм при разных температурах — от 4 до 70°, гидролизовал за 15 мин. почти в шесть раз больше крахмала при 55°, чем при 4°; степень активности препарата была самой высокой под давле-1 нием 1000 атм, затем — при 500 атм и еще меньше было гидролизовано крахмала при 1 атм (рис. 40).

Препарат а-амилазы в буферном растворе сохранялся 56 дней под давлением 1000 атм и температуре 4 и 25°, однако актив­ ность снизилась больше при 25°, чем при 4°. При указанных температурах активность а-амилазы была несколько вышепри- атмосферном давлении (рис. 41), тогда как при 55° она оказа­ лась выше под давлением 1000 атм; полная инактивация фер­ мента произошла позднее под этим давлением (на 42-й день), чем при одной атмосфере (на 28-й день).

Целлюлаза

Испытание активности этого фермента, выделенного из гриба Aspergillus niger, показало (ZoBell, Kim, 1972), что очищенный препарат разлагал примерно одинаковые количества целлюлозы.

69