книги из ГПНТБ / Крисс А.Е. Жизненные процессы и гидростатическое давление

бывания под давлением от 1400 атм и выше. При одномоментном действии эти микроорганизмы (за исключением Bact. typhi u Bact. dipheriae) переносили давление 3750—7500 атм, а при 1,5—3-часовой экспозиции выживаемость наблюдалась только под давлением 1400—3000 атм. Для Bact. typhi u Bact. diphtheriae порогом давления, при котором сохранялась жизнеспособ­ ность, были 2390 атм продолжительностью 10 мин. Среды, в кото­ рых испытывалось влияние гидростатического давления на выжи­ ваемость микроорганизмов (дистиллированная вода, бульон, бульон с различными углеводами), не имели определяющего значения. В некоторых случаях выживаемость была более высокой на дис­ тиллированной воде (Bact. prodigiosum, Saccharomyces cerevisiae), Число живых бактерий было выше после действия высокого дав­ ления при комнатной температуре, чем в опытах при 5 или 40°.

Larson, Hartzell u. Diehl (1918) сообщили, что для неспо­ роносных бактерий летальным оказалось давление 88 000 ф/д2

90

продолжительностью 14 час., тогда как споры теряли жизнеспо­ собность при той же экспозиции, но под давлением 176 000 ф/д2.

В опытах Basset et Macheboeuf (1932) различные виды бак­ терий суспендировались в воде или бульоне и в течение 45 мин. подвергались действию высокого давления. Давление 3000 и 4000 атм не влияло на способность неспороносных бактерий к размножению. Пределом для их выживаемости было давление около 6000 атм. Каких-либо преимуществ в этих опытах бульон­ ная среда не имела.

Luyeli (1937а) подсчитывал число мертвых клеток Saccharomy­ ces cerevisiae в суспензии на водопроводной воде после дейст­ вия давления в несколько тысяч атмосфер. Под давлением 7000 атм отмирание дрожжей происходило через несколько секунд. За 4 мин. под давлением 5000 атм отмирало такое же количество клеток, как за 30 сек. под давлением 6000 атм. Давление 5000 атм уби­ вало 40% клеток за 3 мин. и 70% клеток за 6 мин.

Dow (1939) указывает, что давление 3000—7000 атм стерили­ зовало молоко, убивая молочнокислые бактерии. Стерилизация была наиболее эффективной при комнатной температуре. Про­ цент гибели клеток определялся величиной давления.

По данным Holyoke a. Johnson (1951), лизис клеток Micro­ coccus lysodeicticus под влиянием лизоцима ускорялся при раз­ ных значениях pH в пределах 5,6—8,7, когда давление повыша­ лось до 4000—8000 ф/д2 (рис. 54).

Лизоцим из яичного белка лизировал клетки Micrococcus lyso­ deicticus с возрастающей скоростью, когда гидростатическое дав-

повышалось (ZoBell, Kim, 1972):

Timsou a. Short (1965) показали, что 0,05% микрофлоры мо­ лока сохраняет жизнеспособность после давления 10 000 атм в течение 30 мин. при температурах от — 25 до + 35°. Резистент­ ные к высокому давлению микроорганизмы оказались в основ­ ном спороносными формами. Bacillus subtilis выживал при фазо­ вых переходах льда от II, III, У к I. Наибольшая резистент­ ность этого вида была при нейтральном или слегка щелоч­ ном pH.

91

условиях атмосферного давления потерю жизнеспособности зна­ чительного числа бактериальных клеток, наблюдался противопо­ ложный эффект: гибель клеток Е. coli под давлением 6000 ф/д2 снижалась (рис. 55).

Споры

Larson, Hartzell u. Diehl (1918) сообщили, что споры бактерий теряли жизнеспособность под давлением 176 000 ф/д2 продолжи­ тельностью 14 час. По данным Basset, Macheboeuf (1932), споры Bacillus subtilis прорастали даже после давления около 20 000 атм

уже следовала инактивация спор Bacillus pumilis, было давление в 600 атм продолжительностью действия 6,5 часа. (Clouston, Wills, 1969). Большая чувствительность к давлению наблюдалась у спор, суспензированных в буфере, чем в дистиллированной воде. Рефрактильность спор уменьшалась, а окрашиваемость возрастала с повышением давления или удлинением экспозиции. При больших, величинах давления снижался сухой вес спор и в жидкости опреде-’ лялась кальциевая соль дипиколииовой кислоты. Дыхательная ак­ тивность спор возрастала: поглощение кислорода спорами Вас. pumilus через 80 мин. экспозиции под давлением 850 атм была вы-

92

* Цифры выражают количество жизнеспособных спор.

Т а б л и ц а 28. Изменение количества (в %) жизнеспособных спор у различных видов бактерий под высоким давлением продолжительностью 1 час при 20° (Sale et ah, І970)

Давление, атм

Вид

ше в 10 раз, чем у спор, находившихся в условиях атмосферного давления.

Sale, Gould a. Hamilton (1970) описали интересное явление: под давлением 1000—8000 атм продолжительностью 1 час, при 20°, наибольший процент гибели спор приходился на давление 1500—3000 атм; летальный эффект более высокого давления был меньше (табл..28). Ицактивирующее действие давления за-

93’

Рис. 56. Влияние давления и температуры на жизнеспособность спор Ba­

ратуры в течение 30 мин.; б — то же, что а, но после снятия давления споры дополни­

висело от температуры нагрева спор во время компрессии. Ниже 65° число спор, сохранявших жизнеспособность, уменьшалось.

Типичный характер кривых инактивации спор Bacillus coagulaus, Вас. cereus, Вас. subtilis, Вас polymyxa, Clostridium sporo-

плато под давлением 2000—3000 атм; 3) дальнейшее снижение числа жизнеспособных спор; 4) область (свыше 4000 атм), где инактивация уменьшалась при температурах ниже 55° и увеличи­ валась при более высоких температурах.

Оптическая плотность суспензии инактивированных спор пада­ ла; при фазово-контрастной микроскопии они выглядели темны­ ми, как в процессе прорастания. Электронная микроскопия откры­ ла в них структурные изменения, типичные для прорастающих спор. Давление вызывало также химические изменения: выделе­ ние в жидкость дипиколиновой кислоты, кальция и веществ, со­ держащих гексозамин.

Инактивация спор под давлением происходила в широком ряду значений pH, однако наибольший эффект инактивирующего влия­ ния давления был в области нейтрального pH и явно умень­ шался в направлении к крайним величинам pH.

Авторы отмечают, что степень чувствительности спор к высоко­ му давлению значительно варьировала у разных микроорганизмов.

94

РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ ПОД ДАВЛЕНИЕМ

Баротолерантность бактерий

Описан ряд видов бактерий, не только сохраняющих жизне­ способность под давлением несколько сот атмосфер, но и размно­ жающихся в этих условиях. Более того, наряду с баротолерант­ ными 1 видами, т. е. размножающимися как при атмосферном, так и при высоком давлении, встречаются микробные формы, ко­ торые дают больший урожай под давлением в сотни атмосфер, чем при одной атмосфере. К этим факультативно-барофильным видам примыкают облигатно-барофильные виды, неспособные к размножению при атмосферном давлении (ZoBell, Oppenheimer, 1950). ZoBell а. Johnson (1949) помещали под давлением 300, 400 и 600 атм свыше 30 видов микроорганизмов, выделенных из наземных и морских местообитаний. После 48 час. их пребыва­ ния под давлением при 30° определяли степень помутнения в жидкой питательной среде или подсчитывали число колоний. Как видно из табл. 29, явное размножение некоторых видов проис­ ходило под давлением 300 и 400 атм, хотя урожай клеток был значительно меньшим, чем при 1 атм. Более высокое давление,

Т а б л и ц а 29. Влияние гидростатического давления на размножение бактерий раз­ личных видов

Alkaligenes visco-

1 ZoBell а. Oppenheimer (1950) называют барофобными те виды, которые способны размножаться под давлением не выше 200 атм, н бароустойчи­ выми (baroduric) —виды, размножающиеся лучше при атмосферном, чем при высоком давлении.

95

500 и 600 атм, не препятствовало размножению одного вида Streptococcus lactis; клетки остальных видов в основной массе не размножались или погибали.

В работе этих авторов далее указывается, что имелась кор­ реляция между резистентностью морских бактерий к высокому давлению и местом их обнаружения. Так, виды, которые были выделены из поверхностного слоя воды Тихого океана, были сход­ ны по своему отношению к высокому давлению с видами назем­ ного происхождения. Между тем Bacillus submarinus и Вас. thallassokoites, поднятые с глубин около 5000 м, были более устой­ чивыми к давлению 400 и 500 атм, чем террестриальные виды. Смешанная микрофлора из свежеполученного с глубины 12 000 фу­ тов ила давала в ряде случаев лучший рост при 400 и даже 600 атм, чем при 1 атм. Аналогичным образом некоторые десуль­ фурирующие бактерии, выделенные из нефтяных скважин с глубин в несколько тысяч футов, оказались более активными под давле­ нием 400 и 600 атм, чем в условиях атмосферного давления.

Некоторые виды с больших глубин хорошо росли под давле­ нием 600 атм.

Только несколько видов из обследованной коллекции морских бактерий (ZoBell, Oppenheimer, 1950) размножалось с одинако­ вой интенсивностью под давлением 1 и 600 атм. Размножение большинства видов ингибировалось давлением 200—600 атм при продолжительности 96 час.: из 56 видов у 20 этот эффект достигался уже при 200 атм, у 35 — при 400 атм, а у 48 — при 600 атм. Пять видов утратили способность размножаться при атмосферном дав­

лерантности бактерий к давлению в несколько сот атмосфер от числа бактериальных клеток в посевном материале. Если в нем было от 100 до 1000000 бактерий, заметного влияния на степень размножения четырех штаммов под давлением 1, 200, 400 атм не наблюдалось, тогда как снижение концентрации до ІО2клеток в 1 мл и менее явно отражалось на урожае (табл. 30).

Авторы приводят также данные о баротолерантности 63 видов бактерий морского происхождения:

На баротолерантность как критерий автохтонности микрофло­ ры коричневых углей указывают Beck u. Poschenrieder (1957). Они основываются на результатах сравнительных опытов по раз­ множению под давлением 300 и 400 атм четырех штаммов Pseudo­ monas fluorescens, выделенных из угольных пластов, и 13 видов —

.96

из поив. Эти опыты показали, что толерантность исследованных видов к давлению колебалась в значительных пределах.

Наиболее чувствительными были дрожжи Torula utilis, Hansenula anomala, актиномицеты Streptomyces griseus, Actinomyces albus, которые совсем не размножались под давлением выше

Т а б л и ц а 30. Число жизнеспособных клеток бактерий через четверо суток пребывания под гидростатическим давлением (Oppenheimer, ZoBell, 1952)

200 атм. Из других видов только штаммы Pseudomonas fluorescens, выделенные из угля, размножались в условиях четырехднев­ ного пребывания под давлением 400 атм, остальные — почвенные формы, в числе которых был также штамм Pseudomonas fluorescens, потеряли способность к размножению (табл. 31).

Снижение урожая клеток под давлением 500—750 атм наблю­ дала Чумак (1959) у баротолерантной бактерии Bacterium desmolyticum, выделенной из ила Тихого океана с глубины 4560 м. Количество клеток уменьшилось с 325 млн. при атмосферном давлении до 50,5 млн. под давлением 500—550 атм и до 25 млн.— под давлением 750 атм.

Данные о баротолерантности морских бактерий, гидролизую­ щих крахмал, приводят ZoBell а. Hittle, (1969). Все 19 иссле­ дованных видов размножались на питательной среде с крахмалом под давлением 100, 200, 300 атм продолжительностью семь суток (табл. 32). 400 атм ингибировали размножение 4 видов, 500 атм — 8 видов, 600 атм — 10 видов, а под давлением 800 и 1000 атм только 2 вида, выделенные из ила Марианской впадины, сохра­ нили способность размножаться, но урожай был меньше, чем при атмосферном давлении.

Т а б л и ц а 31. Влияние высокого давления но размножение различных микроорганизмов (Beck, Poschenrieder, 1957)

Т а б л и ц а 32. Размножение морских бактерий, гидролизующих крахмал, под высоим давлением продолжительностью 7 дней, в % от урожая при атмосферном давлении (ZoBell, H ittle, 1969)

Гидростатическое давление, атм

Вид

П р и м е ч а н и е . О— отсутствие размножения, S — отсутствие жизнеспособности.

Начиная с 500 атм, некоторые виды не только не размножа­ лись, но и утрачивали жизнеспособность. При 500 атм был лишь один такой вид, при 600 атм — 4, при 800 — 8 и при 1000 — 12 видов.

Продолжительность лаг-фазы и скорость роста

Исследованиями Vignais, Macheboeuf et Basset (1953b) уста­ новлено, что размножение клеток Salmonella paratyphi С не про­ исходило, если их выдерживали в питательном бульоне 16 час. под давлением 100 атм. Под давлением 2600 атм этот срок умень­ шался до 30 мин., и достаточно было 1—3 мин. пребывания в условиях давления 4600 атм, чтобы полностью затормозить спо­ собность бактериальных клеток к воспроизведению. Восстановле­ ние функции размножения наблюдалось через различные периоды времени после того, как давление уменьшалось до атмосферного. Продолжительность этой лаг-фазы зависела от величины давле­ ния и его длительности.

В опытах по действию высокого давления на микробное на­ селение глубоководных илов и почв наблюдалось следующее яв­ ление — восстановление функции размножения происходило не сразу после декомпрессии, а спустя значительный срок (Крисс,

идр., 1958).

Впервые 1—2 дня после высева на МПА суспензии ила, подвергавшейся давлению 1500—1800 атм, роста не было. Но за­ тем на тех же чашках, которые продолжали выдерживать в тер­

мостате при 26°, появилось вначале небольшое число колоний; в дальнейшем, с удлинением срока температурной инкубации, число колоний значительно увеличивалось. Из табл. 33 видно, что при посеве ила со станции № 890 в Тихом океане выросло 240 тыс. колоний (на 1 г ила). После того как эта суспензия ила подвергалась в течение суток давлению 1680 атм, высев на МПА дал через 24 часа инкубации отрицательные результаты: на поверхности агара не было ни одной колонии. Однако через 48 час. выдерживания в термостате этой чашки с посевом мож­ но было подсчитать 83 тыс. колоний, через трое суток — 136 тыс. и через пять суток — 250 тыс. колоний в пересчете на 1 г ила, т. е'. количество, которое было определено в иле до действия давления.

В другом опыте с илом со станции № 914 в Тихом океане проводились сравнительные наблюдения над динамикой измене­ ний в числе колоний, выраставших после различных сроков ин­

шейся давлению, через 24 часа инкубации выросло 10 тыс. коло­ ний (на 1 г ила), через 48 час.— 124 тыс., а через 7, 9 и 11 дней— 158 тыс. (табл. 33). При высеве же суспензии ила, после