книги из ГПНТБ / Крисс А.Е. Жизненные процессы и гидростатическое давление

АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ В УСЛОВИЯХ ГИДРОСТАТИЧЕСКОГО ДАВЛЕНИЯ

Ранние наблюдения над активностью ферментов под давле­ нием в несколько сот атмосфер были сделаны Regnard (1891). Помещая под давление 1000 атм слюну, желудочный сок, сок поджелудочной железы, он констатировал потерю их активности. Обратимость этого явления оказалась возможной при меньшем давлении. После снятия давления 600 атм дрожжи, не сбражи­ вавшие сахар под давлением, через некоторое время начинали сбраживать его.

Сейчас уже накоплено значительное число сведений, разносто­ ронне характеризующих деятельность под высоким давлением ферментов как изолированных, так и действующих в единой сис­ теме энзиматического аппарата организмов.

Распределение материала в этом разделе, характеризующем влияние повышенного гидростатического давления на ферменты, дано в соответствии с классификацией ферментов, принятой Международным биохимическим союзом в 1966 г. (Номенкла­ тура ферментов, 1966).

ОКСИДОРЕДУКТАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ

Дегидрогеназы

Д е й с т в и е в ы с о к о г о д а в л е н и я на к с а н т и н д е - г и д р о г е н а з у молока описали Robert et Basset (1953). Ак­ тивность этого фермента в сыром молоке возрастала в семь-во­ семь раз под давлением 5000 атм в течение 20 мин. и в четыре раза под давлением 6000 атм в течение 10 мин. При более высо­ ком давлении быстро наступала инактивация. Менее устойчивы­ ми к давлению оказались эмульсия жировых глобул молока в фосфатном буфере и очищенный фермент, который разрушался через 5 мин. после давления 5000 атм.

Влияние гидростатического давления на дегидрогеназные сис­ темы у микроорганизмов было исследовано Morita a. ZoBell (1956). В первых опытах сравнивалась активность процесса вос­

51

становления метиленовой сини в присутствии натриевой соли ян­ тарной кислоты отмытыми клетками Е. coli, которые предвари­ тельно подвергались давлению 600 атм в течение 4 час. или на­ ходились этот срок при атмосферном давлении. Из табл. 16 видно, что после пребывания бактериальных клеток под давлением 600 атм заметно снижалось количество восстановленной сини по сравнению с контролем при одной атмосфере. Увеличение давле­ ния до 1000 атм почти полностью инактивировало дегидрогеназу, тогда как под давлением 200 атм ингибирование фермента было

Т а б л и ц а lß. Количество восстановленной метилсповон сипи (вмиг) отмытыми клетками Е. coli после 4 час. пребывания под давлением G00 атм при температуре 30° (Morita, ZoBell, 1956)

небольшим (рис. 27). Инактивирующее действие давления 600 атм

не с клетками, предварительно подвергавшимися давлению, а со всей системой: отмытые клетки, субстрат, метиленовую синь по­ мещали под давление в цилиндр, снабженный окошком из сапфи­ ра, позволяющим производить оптические измерения изменений в окраске системы. Субстратами служили натриевые соли янтар­ ной, муравьиной и яблочной кислот.

Опыты показали, что уменьшение дегидрогеназной активности 'с повышением давления неодинаково для разных субстратов. Наи­ меньший эффект при подъеме давления ступенями 1, 200, 600, 1000 атм наблюдался с малатом, затем следовали формиат и сукцинат.

Восстановление метиленовой сини бактериальными клетками в отсутствие субстратов увеличивалось с повышением давления: количество восстановленной сини было выше в пять — восемь раз под давлением 1000 атм, чем при 1атм.

Изучение влияния температуры на малатдегидрогеназную ак­ тивность клеток Bacillus stearothermophilus (Morita, Haight, 1962) показало, что оптимум ферментативной реакции лежит в условиях атмосферного давления при температуре 55°. Более вы-

52

Рис. 27. Изменение активности сукцинатдегидрогеназы с повышением гид­

Рис. 28. Влияние высокого давления на малатдегидрогеназную актив­ ность клеток Bacillus stearothermophilus при 101° ((Morita, Haight, 1962)

1 — 41 мин.; 2 — 6 мпп.; з — различие между инкубацией в течение 6 и 41 мин.

сопле температуры снижали активность фермента, и около 80° она полностью утрачивалась.

Однако под высоким давлением дегидрогеназная активность сохранялась при температуре 101°, достигая максимума в ряду

и а-кетоглутаратдегидрогеназы у гриба Allomyces macrogynus с повышением давления наблюдали Hill а. Morita (1962). Никакой активности изоцитрат- и а-кетоглутаратдегидрогеназы не прояв­ лялось под давлением 1000 атм, хотя электронномикроскопиче­ ское изучение митохондрий, пробывших при высоком давлении, не выявило каких-либо отличий их по сравнению с митохонд­ риями, остававшимися при атмосферном давлении.

Активирующее действие давления 4300 ф/д2 на сукцинат-

53

ратом в виде сукцината количество восстановленной метиленовой сини было примерно одинаковым при 1, 200 и 400 атм, затем резко падало в интервале давления 400 и 600 атм; лишь незна­ чительная активность отмечалась под давлением 1000 атм.

Отличием оксалосукцинатдегидрогеназы было постепенное снижение активности с увеличением давления, при 1000 атм она еще заметно проявлялась. Между тем использование в качестве

Рис. 29. Действие давления на активность лактатдегпдрогеиазы из мышц глубоководных и поверхностных рыб (Gillen, 1971)

По осп ординат — уменьшение активности (Да) по сравнению с активностью при атмо­

субстрата а-кетоглутарата выявило третий тип отношения дегид­ рогеназ в митохондриях к давлению: увеличение активности при 200 атм по сравнению с активностью при 1 атм и нулевые зна­ чения восстановленной метиленовой сини под давлением 1000атм.

Gillen (1971) сравнивал чувствительность к давлению до 600 атм лактатдегидрогеназы из мышц четырех видов глубоко­ водных и трех поверхностных рыб. Как видно из рис. 29, ника­ кой закономерности в снижении активности фермента под влия­ нием давления в зависимости от глубины извлечения рыб не наблюдалось.

К а т а л а з а

Активность каталазы дрожжей усиливалась под давлением до 400 атм (Рора, 1965). У хлебных дрожжей активность возрастала на 11,8—27,3%, а у пивных — на 14,0—27,1%.

54

Л ю ц н ф е р а за

Этот фермент привлек внимание исследователей уникальной возможностью мгновенного выяснения его реакции на различ­ ные воздействия, поскольку интенсивность люминесценции опре­ деляется состоянием фермента.

У трех видов светящихся бактерий — Photobacterium phosphoreum, Achromobacter fischeri н Achromobacter harvei — с тем­ пературным оптимумом для свечения соответственно 16, 27 и 32° давление снижало интенсивность люминесценции, когда темпера­ тура в опыте была ниже оптимума, и усиливало свечение, если температурные условия были выше оптимума. Исследователи (Brown et ab, 1941) полагают, что это усиление определяется ин­ гибирующим действием давления на обратимую температурную денатурацию люциферазы.

Гидростатическое давление оказывало обратимое действие на процесс уменьшения интенсивности люминесценции у светящихся бактерий, вызванный спиртом, эфиром, хлороформом, этилкарбаматом, фенилкарбаматом и новокаином (Johnson et al. 1941). Эта реверсия происходила в температурных условиях, при кото-

Рис. 30. Зависимость люминес­ ценции от температуры под дав­ лением 1 (7) и 476 (2) атм (John­ son et al., 1942а)

Рис. 31. Усиление люминесцен­ ции под давлением 6400 ф/д2 (2) при температуре 35° (Brown et al., 1942)

1 — атмосферное давление; стрелки означают, что давление снято

55

рых не наблюдалось заметного эффекта давления на свечение нормальной культуры. Однако обратимость под влиянием давле­ ния не отмечалась, когда свечение снижалось барбиталом, суль­ фаниламидом и 7г-аминобензойной кислотой.

Б работе Johnson, Brown, Marsland. (1942а) показана зависи­ мость между температурой и люминесценцией у светящихся бак­ терий под давлением 1 и 476 атм.

На рис. 30 видно, что давление ингибировало денатурацию фермента, препятствуя таким образом уменьшению интенсивно­ сти свечения, которая наблюдалась при повышенной температуре в условиях атмосферного давления.

Очень отчетливо проявилось влияние высокого давления в следующем опыте (Brown et al-, 1942). Как видно на рис. 31, при температуре 35° и атмосферном давлении довольно быстро прогрессировала термальная деструкция люциферазы, о чем мож­ но судить по уменьшению интенсивности люминесценции. Когда давление было увеличено до 6400 ф/д2, свечение резко возросло и до снятия давления держалось на уровне более высоком, чем при 1 атм. После декомпрессии кривая интенсивности све­ чения круто сипзилась и сравнялась с кривой, отражающей ак­ тивность фермента при атмосферном давлении и высокой темпе­ ратуре.

Денатурирующее действие не только температуры, но и хими­ ческих ингибиторов люциферазы ослабляется в условиях высоко­ го давления (Johnson et al., 1942b). Из испытанных веществ хлороформ и уретан снижали активность фермента на 50% при 1 атм, однако этот ингибирующий эффект полностью снимался, когда давление поднимали до 4000—7000 ф/д2. Интенсивность свечения Photobacterium phosphoreum не отличалась от конт­

нию этилового спирта, этилового эфира, фенилуретана и ново­ каина.

Отрицательный результат был ползшей с другой группой ве­ ществ, уменьшающих люминесценцию. Повышение давления в опытах с сульфаниламидом, ге-аминобепзойной кислотой, хло­

Давление увеличивает стимулирующий эффект малых кон­ центраций фосфатов, кальция и хлористого калия иа люмине­ сценцию Photobacterium phosphoreum (Schneyer, 1951, 1953). При температуре 13° добавление хлористого калия повышало ин­ тенсивность свечения на 10% в условиях атмосферного давления, а под давлением 6000 ф/д2на 72% (рис. 33).

Для суждения о характере действия давления на люциферин и люциферазу вне клетки Bronk, Harvey a. Johnson (1952) экс­

56

трагировали люминесцентную систему из ракушкового ракообраз­ ного Cypridina hilgendorfii. Повышение давления до 5000 ф/д2 усиливало свечение, когда реакция проводилась с неочищенными препаратами люциферина и люциферазы при температурах 14— 34°. Но когда в опытах участвовали очищенные компоненты, ни­ какого эффекта давления не наблюдалось.

Опыты in vitro были также проведены с ферментом из Achromobacter fisheri (Strehler, Johnson, 1954). Реакционную

Рис. 32. Влияние давления иа действие химических ингиби­ торов люминесценции Photobacterium phosphoreum (John­ son et al., 1942b)

1— хлороформ — 0.05М;

г— этилкарбамат(уретан)—0,78М;

6— п-аминобензойная кислота — 0,01М;

7— сульфаниламид — 0.0038М;

S — диэтилбарбитурат натрия; 9 — этиловый эфир — 0,14M; 10 — хлоральгидрат — 0.016М

Рис. 33. Усиление под давлением стимулирующего действия хлористого калия на интенсивность свечения Photobacterium phosphoreum при 13° (Schneyer, 1953)

1 — контроль; 2 — 0.22М КС1

57

смесь составляли из фермента, к которому добавляли НАД-Н-

• (+Н+), флавинмоноиуклеотид и пальмитиновый или другие али­ фатические альдегиды с длинной цепыо, способствующие полу­ чению яркой, долго продолжающейся люминесценции. Сравни­ тельным материалом в изучении влияния температуры и давле­ ния иа эту систему служили интактные клетки бактерии А. й- sheri и Photobacterium phosphoreum.

Результаты оказались идентичными в опытах с бесклеточны­ ми экстрактами из A. fisheri, к которым были добавлены ука­ занные химические соединения, и с бактериальными клетками. Уровень свечения снижался под давлением, если температура была ниже оптимума, и повышался, когда температура превыша­ ла оптимум.

Сходная реакция в опытах іи vitro и in vivo наблюдалась при действии химических ингибиторов люминесценции — сульфанила­ мида и спирта. Как с экстрактами, так и с клетками давле­ ние едва влияло на ингибирование фермента сульфаниламидом, однако с повышением температуры оно уменьшало степень инак­ тивации люциферазы, а с алкоголем в обоих случаях под давле­ нием ингибирующий эффект понижался и возрастал нри темпера­ туре выше оптимума.

Фотохимическое окисление

Давление 6000 атм смещало полосы поглощения фотохими­ ческого реактивного центра у Rhodopseudomonas spheroides в длинноволновой части спектра, относящиеся к бактериофеофптину и бактериохлорофиллу (рис. 34). Квантовый выход ф о т о -

Рис. 34. Спектры поглощения фотохимического реактивного центра Rhodopseudomonas spheroides при 1 (1) п 6000

(2) атм (Clayton, Devault,

1972)

х и м и ч е с к о г о о к и с л е н и я уменьшался при высоком давле­ нии, параллельно со снижением выхода квантов флюоресценции. После снятия давления активность в значительной степени вос­ станавливалась. Эффективность окисления цитохрома с, связан­ ная с фотохимическим окислением, уменьшалась высоким давле­ нием, и этот процесс был необратим (Clayton, Devault, 1972).

58

О ки сл ен и е м а р га н ц а

Катализ о к и с л е н и я м а р г а н ц а штаммом Artlirobacter 37, выращенным при 25°, протекал в условиях комнатной тем­ пературы под давлением 333 и 467 атм, мало отличаясь от конт­ роля (Ehrlich, 1971). Давление 567 атм полностью тормозило окисление. Для штамма Arthrobacter 37, выращенного при 5°, пределом температуры для окисления марганца в условиях ат­ мосферного давления были 10—13°. Наиболее высокие значения чисел, выражающих окисление марганца под повышенным давле­

* Эти контроли инкубировали при 10°.

мом Bacillus 29 прогрессивно уменьшалась с повышением дав­ ления: под давлением 510 атм активность почти соответствовала контролю при 1 атм, а при 1000 атм составляла лишь 11% от него.

В о сстан о в л е н и е н и тр ато в

В опытах с отмытыми клетками, концентрация которых сос­ тавляла 2—5 • ІО9 мл, ZoBell a. Budge (1965) убедились в том, что все 30 видов бактерий, в большинстве случаев выделенных иа поверхностной зоны океана, оказались способными в о с с т а-

59