книги из ГПНТБ / Крисс А.Е. Жизненные процессы и гидростатическое давление

риклеточиых гелей в сторону образования золей, так как эти переходы происходили с уменьшением объема системы. Желати­ на представляла собой обратный пример: разжижение подавля­ лось, а реакция застудевания стимулировалась давлением, по­ скольку гель желатины имел меньший объем по сравнению с золем.

В опытах Suzuki К., Taniguchi a. Enomoto (1972) повы­ шение давления с 2000 до 6000 атм способствовало переходу же­ латины и поливинилового спирта из состояния золя в гель, тогда как гель метилцеллюлозы расплавлялся под давлением.

Овальбумин. Сывороточные белки

Чтобы подтвердить денатурирующее влияние высокого давле­ ния на яичный белок, была определена (Grant et al., 1941) степень обнаженности SH-связей под давлением от 1000 до 7500 атм. Обесцвечивание 2-6-дихлорфенолиндофенолового краси­ теля возрастало с увеличением давления.

Белки кровяной сыворотки также испытывают коагулирующее действие высокого давления.

Установлено (Basset, Macheboeuf, Sandor, 1933), что кровя­ ная сыворотка, сохраняющая прозрачность после действия давле­ ния 3000 атм в течение 30 мин., с повышением давления при той же экспозиции начинает опалесцировать, затем становится клейкой. Давление 13 000 атм вызывает уже полную желатинизацию. Дальнейшие опыты показали, что раздельно подвергну-

10

тые высокому давлению альбуминовые и глобулиновые фракций кровяной сыворотки неодинаково чувствительны к давлению. Гло­ булины коагулировали при 7000 атм, тогда как растворы альбу­ мина не претерпевали изменений даже при 19 000 атм.

на эту устойчивость. Выяснилось, что после 16-часовой продол­ жительности давления 10 000 атм, при pH, близком к изоэлектри­ ческой точке (4,3—4,7), молекулы альбумина образовывали нити. Раствор белка разделялся на две фазы, различающиеся по кон­ центрации нитей; часть их выпадала в осадок. В опытах, где pH был несколько выше — 4,85, двухфазность раствора отсутство­ вала, появлялся осадок, жидкость над которым была прозрачной. В более кислой среде (pH 3,9) альбумин не претерпевал изме­ нений — раствор оставался прозрачным.

Серия более детальных исследований денатурации яичного белка и гемоглобина под действием повышенного давления была опубликована Suzuki et ab

В первых работах (Suzuki К., 1957, 1958) автор установил, что с повышением давления на яичный белок, начиная с 3000 — 4000 атм, плавно уменьшается содержание азота в надосадоч­ ной жидкости до порога давления (6000 атм), после которого концентрация азота мало или совсем не изменяется. Влияние pH на денатурацию белка было максимальным в изоэлектриче­ ской точке: наибольшая величина мутности и наименьшее со­ держание азота наблюдали в надосадочной жидкости. Отмечено также явно задерживающее действие температуры (71,5°) на денатурацию овальбумина при высоком давлении.

Процесс денатурации овальбумина под действием высокого давления был изучен с помощью и других методов (Suzuki С., Suzuki К., 1962): по растворимости, измененшо угла вращения плоскости поляризации и протеолизу. Оптический метод приме­ нялся, поскольку он позволял судить об изменениях во вторич­ ной структуре белка, тогда как отношение к протеазам полнее выявляло отличие денатурированного белка от нативного.

Исследования показали, что результаты определения денату­ рирующего влияния высокого давления по растворимости и про­ теолизу совпадали: денатурация овальбумина начиналась под дав­ лением около 5000 атм и заканчивалась под давлением около 9000 атм (рис. 1). Совпадение паблюдалось также в кривых де­ натурации, полученных по растворимости и оптическим методом (рис. 2). Авторы отмечают, что под высоким давлением измене­ ния утла вращения плоскости поляризации были значительно меньшими, чем в результате денатурации овальбумина теплом и мочевиной; о полноте денатурации белка под давлением сви­ детельствовали полнота осаждения и гидролитического разложе­ ния его бактериальной протеазой.

И

Учитывая, что результаты действия высокого давления на яичный белок выясняли после снятия давления, а это могло при­ вести к искажению их, так как известны случаи возвращения некоторых белков в первоначальное состояние, когда удалялся денатурирующий агент, Suzuki К., Miyosawa a. Suzuki С. (1963) применили аппаратуру, позволяющую наблюдать изменения в со­ стоянии белка непосредственно во время его пребывания под высоким давлением. В аппаратуре имелось световое окошко из искусственного сапфира, позволяющее измерять мутность белко­ вого раствора под давлением 10000 атм.

Мутность раствора овальбумина почти не менялась с повы­ шением давления в течение 8 мин. до 5000 атм, затем, когда давление превысило 5000 атм и достигло 6000 атм, мутность за 1— 2 мин. резко возросла почти до полной непроницаемости для светового луча (рис. 3). С понижением давления до атмосфер­ ного мутность сохранялась, указывая этим на необратимость де­ натурации овальбумина.

Иную картину наблюдали в опытах с альбумином лошадиной сыворотки. Как и с овальбумином, под давлением свыше 5000 атм прозрачность раствора почти полностью исчезла, но, как только давление начали снижать, мутность стала уменьшаться, достигнув первоначальной величины при атмосферном давлении (рис. 4). Снятие высокого давления при определенных pH приводило к полной реверсии денатурированного альбумина к исходному в та­ ких чертах, как растворимость в воде в изоэлектрической точ­ ке, вращение плоскости поляризации, спектр поглощения в ульт­ рафиолетовых лучах, реактивность сульфгидрильных групп; раз­ личия наблюдались лишь в отношении растворимости в 10% -ном растворе сернокислого натрия и чувствительности к протеолизу (Suzuki С., 1963а).

В других работах (Suzuki С., Suzuki К., 1963, 1964) описы­ ваются условия, которые влияли на жѳлатинизацию овальбуми­ на в самых низких концентрациях его под высоким давлением. Желатинизация происходила только в узких пределах pH, но с увеличением давления с 6000 до 8000 атм пределы расширялись главным образом за счет более высоких значений концентрации водородных ионов. С повышением температуры с 10 до 30°, при pH 4,0 и давлении 8000 атм, возрастала величина минимальной концентрации яичного белка, которая требовалась для образования геля, тогда как при pH 5,0; 6,0; 7,5 она понижалась (рис. 5).

Авторы приводят фотографии, раскрывающие особенности желатинизации овальбумина, подвергавшегося давлению 8000 атм в течение 5 мин. Опыты были поставлены при нескольких зна­ чениях pH с различными концентрациями овальбумина, близки­ ми к самой малой концентрации, при которой еще образовывал­ ся гель.

На рис. 6 видно, что минимальные концентрации овальбуми­ на, образующие гель под давлением 8000 атм, выше при pH

13

Рис. 5. Влияние температуры иа величину минимальной концентрации бел­ ка, необходимой для перехода в гель (МКБГ) под действием высокого дав­ ления (8000 атм) продолжительностью 5 мни. (Suzuki С., Suzuki К., 1963)

С ацетатным буфером: 1 — pH 4,0; 2 — pH 5,0. С фосфатным буфером: з — pH 0,0; і — pH 7,5

Рис. 6. Зависимость между pH и величиной минимальной концентрации белка, при которой образуется гель (МКБГ) под давлением 8000 кг/см2 (Suzuki С., Suzuki К., 1964)

Рис. 7. Влияние давления на денатурацию белков (Suzuki К. et al., 1968)

1 — ß-лактоглобулин; 2 — у-глобулин; з — а-амилаза

Рис. 8. Влияние давления на метгемоглобин (1), восстановленный гемо­ глобин (2), карбоксигемоглобин(3) и оксигемоглобин (4) (Suzuki К., Kitamura, 1960)

Температура 20°, pH 6,8; продолжительность давления 5 мин.; исходная концентрация 0,3—1,0%; С — концентрация

около 4,0 и 8,0 (3,1—3,6%), чем в пределах значений pH между ними, когда минимальные концентрации овальбумина были близ­ ки к 1%.

При pH 3,9 и 8,0 гели были эластичными и блестящими, между тем как при pH 4,8 им не были свойственны эластич­ ность и блеск. Примечательно, что все гели, полученные при разных концентрациях овальбумина и значениях pH и иных вели­ чинах давления, чем 8000 атм, были непрозрачными. Это явилось контрастом по отношению к прозрачным гелям овальбумина, кото­ рые возникали под действием мочевины.

Величина давления, которая определяет начало денатурации глобулярных белков, зависит от температуры, pH и растворителя (Suzuki К. et al., 1968). На рис. 7 показана зависимость этой величины от природы белка: пятиминутное действие давления 3000 атм уже вызывало денатурационный процесс у ß-лактогло- булина, тогда как для а-амилазы требовалось давление 6000— 7000 атм. С повышением давления коагуляция белков возраста­ ла. В отличие от сывороточного глобулина, снятие давления не приводило- к ренатурации а-амилазы, ^-глобулина и ß-лактогло- булина.

Гемоглобин

Исходя из неопубликованных данных Davis A.R. о коагуля­ ции крови под высоким давлением, Bridgman a. Conant (1929) поставили своей задачей получить нерастворимую форму гемогло­ бина с помощью высокого давления. В своих опытах они исполь­ зовали карбоксигемоглобин, который подвергали давлению 9000 атм от 15 до 113 час. при температуре 20—25°. После сня­ тия давления стал заметным красноватый осадок. Скорость дена­ турации гемоглобина отвечала реакции первого порядка и была выше в кислой среде, чем в нейтральной.

Suzuki К., Kitamura (1960) исследовали состояние гемогло­ бина в четырех его модификациях — оксигемоглобин, карбокси­ гемоглобин, восстановленный гемоглобин и метгемоглобин — пос­ ле пребывания под высоким давлением. Оксигемоглобин денату­ рировался и коагулировал под давлением 6000—7000 атм, но не­ полностью; полной коагуляции не наблюдалось даже при более высоком давлении (9000 атм) и удлинении экспозиции его дей­ ствия. В процессе коагуляции красная окраска сменялась ко­ ричневой, спустя несколько часов после снятия давления часть коагулята переходила в растворимое состояние.

Форма кривых коагуляции оксигемоглобина, карбоксигемогло­ бина, восстановленного гемоглобина и метгемоглобина была одно­ типна (рис. 8), однако величины давления, которые требовались для получения одинакового соотношения растворимой и нераст­ воримой фракций, в этих модификациях гемоглобина были раз­ личными. Наименьшая величина давления (4000 атм) отмечена

15

для метгемоглобина, затем следовали восстановленный гемогло­ бин (6000 атм), карбоксигемоглобин н оксигемоглобин (7000 атм).

Коагулированный давлением белок карбоксигемоглобина в изоэлектричѳском пункте имел розово-красную окраску, на воздухе она становилась коричневатой. Температурный коэффициент ско­ рости денатурации в ряду температур от 10 до 70° был отрица­ тельным при температуре ниже 30° и положительным — выше 30°. Выше 70° скорость тепловой денатурации задерживалась давлением до 2000 атм, а затем, с дальнейшим повышением его, возрастала.

Чтобы составить представление о том, влияет ли гидростати­ ческое давление на процесс окисления гемоглобина в оксигемо­ глобин (немаловажное обстоятельство для суждения о дыхании животных в глубинах океана), Johnson а. Schlegel (1948) при­ менили давление 680 атм, соответствующее глубинам около 7000 м.

Выяснилось, что под этим давлением равновесное состояние гемоглобин — оксигемоглобин (гемоглобин извлекался из эритроци­ тов бычьей крови) не менялось заметным образом по сравнению с атмосферным давлением, хотя окисление гемоглобина производи­ лось при разном парциальном давлении кислорода — от 1,5 до 152,0 мм рт. ст. Авторы указывают, что было бы интересно поста­ вить аналогичные опыты с гемоглобином крови морских живот­ ных, включая глубоководных рыб.

у-Глобулин

Денатурация этого белка проводилась (Suzuki К., Miyosawa, 1965) под давлением от 4500 до 7000 атм. Коагулирующий эффект возрастал с повышением давления, ускорялся с увеличением пер­ воначальной концентрации глобулина и понижением pH. Трех­ кратная смена компрессии (4500 атм в течение часа) и деком­ прессии не изменила процент коагулированного белка. В том же опыте, где после снятия давления 4500 атм, действовавшего два часа, оно было вновь поднято на тот же срок до 5000 атм, про­ цент коагулированного белка стал тем же, что в опыте с одно­ кратным применением давления 5000 атм. Оставшийся в растворе белок после смен компрессии и декомпрессии по перевариваемости протеолитическими ферментами, спектру поглощения, углу вращения плоскости поляризациии и растворимости мало отличал­ ся от нативного белка.

16

nais, Barbu, Daniel et Macheboeuf (1954) и Vignais, Lecomte et Macheboeuf (1953) c Salmonella paratyphi С, в которых испы­ тывалось отношение трех антигенов О, Н, Уі этой бактерии к действию давления 1500 эти (в течение 16 час.) и давления 5000 атм (30 мин.). Контролем служила вакцина, приготовлен­ ная обычным методом: бактериальные клетки убивали нагревани­ ем один час при 57° в условиях атмосферного давления.

Через 30 дней иммунизация кроликов бактериями, находив­ шимися 16 час. под давлением 1500 атм, иммунная сыворотка имела тот же титр агглютинирующей способности к антигену Н, что и нагретая вакцина. Наблюдалось некоторое увеличение тит­ ра в тестах с антигеном О по сравнению с контролем и значи­

18

19