книги из ГПНТБ / Крисс А.Е. Жизненные процессы и гидростатическое давление

Сходные результаты были получены также в оптимальных условиях (pH 4,2 и 37°) и условиях, характерных для больших глубин океана (pH 8,2 и 4°).

Агараза Гидролиз агара очищенным ферментом из морской бактерии

нием давления (ZoBell, Kim, 1972). При 4° этот фермент ока­ зался более устойчивым, чем при более высоких температурах; степень барорезистентности в значительной мере зависела также от величины pH:

Активность агаразы в этом ряду величин давления была в два раза выше при pH 7,0, чем при pH 8,2, характерном для мор­ ских глубин.

Хитиназа

Бактерии, выделенные Seki a. Taga (1963), были способны разлагать хитин не только в условиях атмосферного давления, но и под давлением в несколько сот атмосфер. С повышением давления количество хитина, разложенного за четверо суток при 25°, уменьшалось с 84 мг при 1 атм до 17 мг при 600 атм; под давлением 200 и 400 атм было разложено 35 и 28 мг соот­ ветственно. Авторы полагают, что повышенное давление подавляло рост бактерий или синтез фермента.

Фенилгликозидаза

Berger (1958) определял активность ф е н и л г л и к о з и д а з ы

а также и при 45° увеличение давления снижало скорость фер­ ментативного гидролиза субстрата. G повышением давления и тем­ пературы возрастала степень гидролиза спустя 10 — 15 час. после начала опыта, что указывало на ингибирующее действие высокого давления на процесс температурной инактивации фермента.

70

Этот процесс зависел от наличия или отсутствия субстрата, когда фенилгликозидазу помещали под давление. В отсутствие субстрата высокое давление ускоряло инактивирующее влияние нагрева и замедляло инактивацию, если фермент помещали под давление вместе с субстратом.

Пепсин

В опытах с кристаллическим п е п с и н о м Matthews, Dow а Anderson (1940) отметили, что активность фермента не снижа­ лась после пребывания под давлением 1000 атм в течение 6 час. Пятичасовая экспозиция под давлением 5000 атм снизила актив­ ность пепсина на 25%, когда температура была 0°, и на 60% при 35,5°. Полная инактивация пепсина происходила под давле­ нием 6000 атм. Помимо температуры, отмечена зависимость степе­ ни утраты активности фермента под высоким давлением от про­ должительности действия его, состава буфера и концентрации водородных ионов.

Авторы указывают, что вероятной причиной инактивации вы­ соким давлением пепсина является денатурация белка и этот

неактивен после действия давления 7700 атм в течение 5 мин. при pH от 2,0 до 5,2. В условиях меньшего давления, 6180 атм, при той же продолжительности его действия и ряда значений pH от 1,5 до 6,5 максимум сохранения активности фермента наблюдался при pH 3,5—4,0, а полная потеря активности про­ исходила ■при pH 6,5. Степень инактивации пепсина под давле­ нием зависела и от концентрации фермента: утрата активности была наименьшей, когда опыты проводили при высоком содержа­ нии пепсина в растворе.

Увеличение экспозиции высокого давления с 5 до 60 мин. привело к уменьшению процента сохранения активности фермен­ та в пять раз. После трехкратного повышения давления до 5570 и 6180 атм на 5 мин. и снижения до 400 атм на такой же срок активность была вдвое ниже по сравнению с результатами не­ прерывного действия этих величин давления в течение 15 мин.

Влияние продолжительности давления и многократного при­ менения его на сохранение активности (в %) пепсина (Curl, Jansen, 1950b) показано ниже.

71

Трипсин и химотрипсин

Трипсин Мерка снижал активность на 55 % после 5 мин. давле­ ния 13 500 атм, а при 16 000 атм — более чем на 75% (Macheboeuf, Basset, 1934). Задержку гидролиза желатины панкреатическим соком под давлением 1500 атм в течение часа наблюдал также Benthaus (1942).

Curl a. Jansen (1950а) провели исследования кристалличе­ ского трипсина и химотрипсина. G повышением pH усиливался инактивирующий эффект высокого давления — 7700 атм, причем сильнее он был выражен у химотрипсина, особенно при значении pH выше 5,0 (рис. 42). Ниже pH 4,0 практически активность обоих ферментов под этим давлением не снизилась.

Влияние pH сказывалось и на устойчивости трипсина и химотрипсина к возрастанию величины давления. На рис. 43 видно,

тем снижения pH до 2,0 и выдерживания раствора фермента при комнатной температуре в течение 3,5 часа.

а, наоборот, происходит его инактивация, увеличивающаяся с повышением давления от 6700 до 7500 и 8400 атм. Аналогичное явление имело место при постоянном давлении и смещении pH в щелочную сторону. При pH 3,1 после пятиминутного давления 7700 атм и двухчасового активирования химотрипсиногена трип­ сином активность фермента составляла 92% от контроля, а при pH 5,6 и 7,6 — 72 и 41 % соответственно.

Высокое давление не ускоряло процесс активирования химот- 'рипсиногена трипсином. Давление менее 1000 атм не оказывало влияния на активность смеси,, более высокое — снижало ее и пос­ ле действия давления 3000 атм препарат был полностью неакти­ вен.

Денатурирующее действие высокого давления на трипсин ока­ залось отличным от инактивации нагреванием (Talwar, Macheboeuf et Basset, 1954). В серологических опытах сравнивали нативный трипсин, трипсин, который кипятился в течение двух минут, и трипсин, подвергавшийся давлению 600 атм в течение •получаса. Авторы указывают, что денатурированные кипячением ~и давлением препараты трипсина сохраняют, некоторые факторы, •имеющиеся в исходном трипсине, наряду с факторами, частич­ но измененными и новыми, не обнаруженными в нативном трип­ сине.

Кинетику инактивации давлением трипсина и химотрипсина исследовали Miyagawa a. Suzuki (1963а, b). Потеря активности ферментов возрастала с повышением давления, критической вели-

72

Рис. 42. Влияние pH на процесс инактивации трипсина и химотрипсина (Curl, Jansen, 1950а)

Продолжительность 5 мин., концентрация трипсина (Т) 0,067 мг/мл и химотрипсина

чиной было давление 114 000 ф/д2 для трипсина и 85 300 ф/д2 для химотрипсина. Ниже критического давления повторное дейст­ вие его вызывало такую же степень инактивации, как однократ-. ное, если экспозиция в обоих случаях была одинаковой. Выше критического давления повторение компрессии имело своим ре­ зультатом больший инактивирующий эффект, чем при одиночном воздействии давления. Весь процесс снижения активности трип-?, сина и химотрипсина соответствовал реакции первого порядка.

Примерно одинаковые количества белка, «Azocoll», выделен­

ментов с повышением давления. Под давлением 1000 атм 'относи-^

73'

Желатиназная активность

Ж е л а т и н а з н а я активность морского вибриона, облигатно­ го психрофила, заметно не снижалась под давлением 1— 200 атм при 10°, однако с повышением давления до 300 атм она резко падала и затем не изменялась в условиях 400 — 600 атм (Wei­ mer, Moi'ita, 1968).

• При 40° давление оказывало незначительное влияние на ак­ тивность фермента, но при 25° наблюдалось самое большое угне­ тение желатиназы под давлением 1— 100 атм.

Протеолиз

Протеолиз под давлением до 10 000 ф/д2 исследовали Wer­ bin а. McLaren (1951). Было испытано влияние давления на скорость гидролиза казеина и этилового эфира тирозина химотрипсином. Относительная скорость распада казеина в условиях атмосферного давления составила 1,18-ІО-2 мин. Под давлением 4000 ф/д2 она возросла до 1,39-10-2 мин. и достигла 1,56-ІО-2 мин. с повышением давления до 7000 ф/д2.

Большее ускорение гидролитического распада произошло при замене казеина другим субстратом — этиловым эфиром 1-тирози­ на. Скорость гидролиза его химотридсином повысилась с 3,3-ІО-4 до 4,3-ІО-4 моля/литр/мин., путем изменения давле­ ния от атмосферного до 8000 ф/д2.

Активирующее действие давления иа протеолиз описали так­ же Talwar, Macheboeuf et Basset (1954). Под давлением 500 атм скорость разложения желатины трипсином была выше, чем при атмосферном давлении. Однако высокое давление — 6000 атм — снижало скорость протеолиза.

В работе Воробьева (1958) определялась скорость фермен­ тативного гидролиза дипептидов и сывороточных белков. С увели­

из дрожжей, замедлялся: при 4500 — 5000 атм процесс полностью подавлялся.

Несколько иные результаты были получены с сывороточным альбумином и глобулином. Триптическое расщепление этих бел­ ков ускорялось давлением до 2000 атм, а затем при дальнейшем повышении давления до 4500 — 5000 атм происходило постепен­ ное снижение протеолиза до нуля. Примечательно, что ускоре­ ние гидролиза сывороточных белков химотрипсином наблюдалось в области величин давления до 4000 атм, а полное прекращение активности фермента наступало лишь под давлением 6000 — 6500 атм (рис. 44). Ингибирование протеолиза высоким давле­ нием было обратимым процессом, он возобновлялся после снятия давления и протекал с такой же скоростью, как при атмосфер­ ном давлении.

74

Рис. 44. Влияние давления на скорость гидролиза сывороточного альбумина (1) и сывороточного у-глобулина (2) трипсином (а) и химотрипсиноы (б) в 0,01 М аммонийном буфере с pH 9,15 (Воробьев, 1958)

Время гидролиза 90 мин., Е!в0 — разница между коэффициентом поглощения при Я, 280 нм продуктов, растворимых в трпхлоруксусной кислоте, в данный момент процесса и в начале опыта

Автор отмечает, что увеличение скорости протеолиза трип­ сином под давлением до 2000 атм и химотрипсином — до 4000 атм не может быть объяснено эффектом смещения равновесия в сто­ рону гидролиза, так как в опытах активация имела место не только в аммонийном и фосфатном буферных растворах, где

ментативных реакций под давлением. Достоинства метода ИМ продемонстрированы на примере определения скорости образова­

ния и под давлением 500 атм. В течение 50-минутной продол­ жительности опыта никаких различий в скорости гидролиза при

давления и высокой температуры. Под давлением 75—80 ф/д2и температуре 180° в 20%-пом растворе соляной кислоты удалось по­

?5

рировали Пасынский и Талмуд (1952). Опыты по взаимозамещению тирозина и фенилаланина в сывороточном глобулине и сыво­ роточном альбумине проводили в присутствии кристаллического трипсина под давлением 5400 атм при 37°.

Было установлено, что взаимозамещение этих аминокислот под высоким давлением не происходило в отсутствие фермента. То обстоятельство, что сероальбумин или сероглобулин помеща­ ли в бомбы в нативном состоянии и уровень аминного азота после снятия давления не отличался от уровня в растворе бел­ ка, находившегося при атмосферном давлении, говорит против сколько-нибудь заметного гидролиза, т. е. указывает на возмож­ ность замещения непосредственно в неизмененной молекуле белка.

По мнению Пасынского и Талмуда (1952), нельзя рассматри­ вать этот процесс таким образом, что из совершенно неповреж­ денной белковой молекулы вырывается одна аминокислота и на то же место включается другая. Авторы считают более правиль­ ным представлять замещение аминокислот в белковой молекуле как результат динамического равновесия ферментативного гидро­ лиза и ресинтеза, затрагивающего лишь некоторые участки мо­ лекулы белка.

выделившегося аммиака в результате энзиматического разложе­ ния мочевины, трехчасовое действие давления 500 атм уменьши­ ло активность бактериальных уреаз примерно на 40 %, а такая же экспозиция давления 1000 атм привела к снижению ее на 50 — 65%. Продажный препарат уреазы оказался менее устойчивым к этим величинам давления: его активность понизилась соответ­ ственно на 65 — 80%.

.пребывание под давлением 4000 атм приводило к полной инакти­ вации АТФазы миозина, за исключением одной повторности, в которой оставалась небольшая активность. Между тем водораст­ воримая аденозйнтрифосфатаза после снятия этого давления обла- -дала исходной активностью.

;:76

В другой работе (Иванова, 1953) испытывалась устойчивость к высокому давлению аденозинтрифосфатазы так называемых «структурных белков», выделенных из ткани саркомы Мі. Через 10 мин. воздействия давлением 4000 атм практически полностью сохранялась аденозинтрифосфатазная активность этих белков (табл. 21). Таким образом, сопоставление полученных результа­ тов с данными предыдущей работы показало, что в отношении АТФазы имеется резкое отличие «структурных белков» злокаче­ ственной опухоли от миозина по резистентности к высокому дав­ лению.

Т а б л и ц а 21. Влияние высокого делении (4000 атм, 10 мин.) па аденозиптрифосфатазную активность «структурных белков» крысиной саркомы Mj (Иванова, 1953)

АТФаза из мышцы, активированной магнием, и свежеприго­ товленный препарат АТФазы миозина ингибировались давлением 14 300 ф/д2 (Murakami, 1958).

Серию статей, освещающих вопрос об аденозинтрифосфатазной активности миозина в условиях различных величин давле­ ния, температуры и pH, опубликовали Guthe с соавторами (Guthe, 1957, 1969; Guthe, Brown, 1958; Guthe et al’, 1958).

Давление 12 000 ф/д2 повышало эту активность миозина из скелетной мышцы кролика в 2,5—3 раза (рис. 45) (Brown et al., 1958). Наблюдалась зависимость действия давления от pH. Ниже 7,0 активность аденозинтрифосфатазы миозина снижалась и увеличивалась в щелочной зоне. Возрастание активности под дав­ лением 12 000 ф/д2 происходило и при увеличении концентра­ ции кальция, который активирует АТФазу миозина. Взаимодейст­ вие температуры и давления на аденозинтрифосфатазную актив­ ность выразилось в повышении ее под давлением при высоких температурах и снижении или отсутствии изменений при низких температурах.

Эти опыты были повторены с АТФазой миозина, активиро­ ванной магнием (Wilson, Guthe, 1961), оптимум активности которой отмечался при pH 7,4. Температурный оптимум был при 40°, с понижением температуры активность фермента не-

77

Рис. 45. Возрастание АТФазной активности миозина с повышением давле­ ния при 30° и pH 8,4 (Brown et al., 1958)

Ао — при атмосферном давлении; Ар — при повышенном давлении

Рис. 46. Влияние величины давления на АТФазную активность актомиозина (Иванов и др., 1960)

Концентрация актомпозпна 0,57 мг N на 1 мл

обратимо уменьшалась. Давление также оказывало необратимое инактивирующее действие; при температуре 25° и давлении 8000 ф/д2 активность падала на 30%, однако снижение темпе­ ратуры до 15° или повышение ее до 38° заметно уменьшало ингибирующий эффект давления.

Сравнение аденозинтрифосфатазной активности миозина из голотурии и из скелетной мышцы кролика показало (Guthe,1969), что зависимость от концентрации иона кальция и pH идентична

•10-', для карпа — 9,7-10-'.

78

у этих двух объектов. Так же одинаково ингибировалась актив­ ность под давлением при низких pH активировалась при высоких, высоких.

АТФазная активность миозина и актомиозина полностью ис­ чезала в условиях давления 2500 — 3000 атм (рис. 46); при 1500 атм активность АТФазы актомиозина уменьшалась на 30% (Иванов и др., 1959; 1960).

При сравнении АТФазной активности актомиозина из мышц теплокровных и холоднокровных животных (Лебедева и др., 1965)

Т а б л и ц а 23. Изменение Qp и относительной вязкости растворов актомиозина, вы­ деленных пз мышц теплокровных и холоднокровных животных (Лебедева и др., 19В5)

П р и м е ч а н и е . Q — АТФазная активность.

оказалось, что устойчивость ее к высокому давлению в два раза выше у кролика и голубя, чем у лягушки и карпа. Такого же рода различия наблюдались и в отношении изменения относи­ тельной вязкости актомиозина (табл. 23). Общим для обеих групп животных было увеличение количества свободно реагирующих сулЬфгидрпльных групп с повышением давления от 1 до 1000— 1500 атм (табл. 22).

79