книги из ГПНТБ / Крисс А.Е. Жизненные процессы и гидростатическое давление

тшю. Пятиминутное действие давления около 2000 атм оказыва­ лось достаточным для значительного снижения титров фагов Т2 и Т5. Между тем примерно такая же степень инактивации на­ блюдалась у фага Т4 под давлением около 2500 атм (рис. 23). Автор указывает, что эти фаги по своей чувствительности к дав­ лению располагаются в таком же порядке, как и в отношении чувствительности к ультрафиолетовым лучам. Несмотря на сходст­ во в морфологии фагов Т2 и Т4, их чувствительность к высокому давлению была неодинаковой.

Т а б л и ц а 10. Устойчивость актинофагов в лизогенных культурах Act. levoris* и Act. oHvaccus к высокому давлению (в атм) (Раутенштейн, Мурадов, I960)

* Средине данные из трех опытов.

Более подробное изучение влияния высокого давления (529— 2645 атм) на размножение бактериофага Т2 показало (Rutberg, 1964), что способность клеток Е. coli к размножению и их способность продуцировать фаг инактивировались примерно с оди­ наковой скоростью. Давление удлиняло латентный период в раз­ множении фага в бактериальной клетке пропорционально времени после инфекции, в течение которого бактерии подвергались дав­ лению. Чувствительность внутриклеточного фага к давлению за­ висела от состояния зрелости его в инфицированной клетке. Неко­ торые данные свидетельствовали о большей чувствительности к давлению внутриклеточного фага, чем внеклеточного.

Раутенштейн и Мурадов (1966) исследовали устойчивость ак­

к высокому давлению. Как видно из табл. 10, актииофаги к Act. levoris сохраняли свой титр после давления 200 атм в те­ чение 30 мин. и снижали его после давления 500 атм. Особенно

40

заметно падал титр этих фагов после давления 700 атм. Напро­ тив, актинофаг к Act. olivaceus полностью выдерживал давление 700 атм: число активных корпускул фага после снятия давления равиялось их концентрации в исходном фаге.

И зм ен ен и е м о р ф о ло гии

Электрониомикроскопические исследования Крисса и Тихо­ ненко (1953) показали, что в препаратах бактериофага Bacillus mycoides, пробывших под давлением 5000 атм 4 часа, обнаружи­ ваются нити различной длины, прямые или в отдельных местах слегка изогнутые и искривленные, 16—20 ммк в поперечнике. При экспозиции 48 и 72 часа они были найдены в больших коли­ чествах и значительной длины, до 4,4—4,8 мк, встречались так­ же нити толще обычных, до 50 ммк, судя по фотографиям явля­ ющиеся пучками тонких нитей, тесно прилегающих друг к

другу.

В дальнейшем было изучено (Крисс, Тихоненко, 1953) влия­ ние более высокого давления — 6000, 8000, 9000 атм; продолжи­ тельность давления варьировала от 24 до 120 час. Чтобы выяс­ нить, насколько однотипна реакция различных фагов на высокое давление, опыты проводили с бактериофагами Bacillus mycoides,

шегося гидростатическому давлению 6000, 8000 и 9000 атм, на­ блюдались нити различной длины — 350—6000 ммк, толщина ни­ тей колебалась в пределах 15—20 ммк; можно было видеть также пучки тонких нитей. Наряду с нитями обнаруживались бесхвос­ тые головки и крупные, округлые, возвышающиеся пли утолщен­ ные образования, разрыхленные или зернистые, напоминающие головки фаговых частиц в стадии разрушения.

У бактериофагов Bact. lactis aerogenes, Staph, aureus, Strept. lactis и актинофага Act. globisporus давление 6000, 8000, 9000 атм не приводило к возникновению нитевидных структур. В поле зрения электронного микроскопа были видны картины деформи­ рующего или разрушающего действия высокого давления на кор­ пускулы фагов.

Имелись различия в сохранении литической способности фа­ гов после высокого давления. Инактивация всех фаговых частиц произошла у фагов Вас. mycoides, Bact. lactis aerogenes, Staphylo­ coccus aureus, Streptococcus lactis (штамм РЖ ), тогда как у Strept. lactis (штамм 28) и актинофага Act. globisporus после двухсуточ­ ного действия давления 9000 атм титр оставался равным ІО3. Ли­ тическая способность фагового корпускула не коррелировала с его сперматозоидоподобной фигурой. У 'бактериофага Bact. lactis aerogenes масса корпускул после высокого давления сохранила свой нормальный вид, но литическая, аздццнрсд^ их была , равна

41

нулю. В то же время у стрептофага (штамм 28) при полном от­ сутствии характерных фигур фага титр был равен ІО3. По-види­ мому, литическая способность фаговых корпускул коррелятивно связана с более тонкими чертами их строения, чем это улавли­ вается сейчас при помощи электронного микроскопа.

Характерные изменения в морфологии фага Т4 происходили под давлением около 4500 атм (Solomon et al., 1966). Наряду с нормальными частицами фага с головками, содержащими ДНК, и растянутой оболочкой хвоста наблюдались частицы с нормаль­ ными головками и сжавшимися чехлами хвоста, частицы с пусты­ ми головками и сжавшимися чехлами хвоста и частицы с пустыми головками и нормальной оболочкой хвоста. Последняя группа со­ ставляла такой же процент от всего количества корпускул фага, как II в контроле.

Пребывание фага Т4 в течение 15 сек. под давлением 4500 атм и 25° уже приводило к отчетливому уменьшению количества частиц фага с нормальной морфологией. При пятиминутной экс­ позиции давления процент их уменьшался до семи (табл. 10). Снижение температуры до 6° или повышение ее до 45° вызы­ вало сокращение оболочки хвоста у 100% фаговых частиц. При­ мечательно, что на этом фоне при 30° свыше 40% фаговых кор­ пускул сохраняло характерную для фага Т4 ультраструктуру. Однако процесс высвобождения ДНК из головок резко усили­ вался с повышением температуры от 6 до 25, 30 и 45°. Про­ цент частиц фага с пустыми головками с 42 при 6° достиг соответственно 87, 90, 95 (табл. 11).

Авторы указывают, что изменения в структуре хвоста у фаго­ вых частиц электронномикроскопически сходны с изменениями его при контакте фага с клетками хозяина; наблюдалось втяги­

*-Форма головок не принята во тшимание.

Ш

43

ки после давления 2000 атм также могут освобождать фаг, но

taches vierges, иммунные к действию фага из сферопластов, подвергавшихся давлению, обладали способностью вызывать лпзоіению клеток оригинальной культуры Е. coli. Образовавшиеся

Электронномикроскопические исследования показали, что фаг, индуцированный действием высокого давления на Е. coli, по диа­ метру головки, длине хвоста, соотношению высоты и диаметра головок близок к вирулентному фагу Т5 и умеренным фагам Р1 и ламбда (Edebo, Rutberg, 1960).

Индуцирующий эффект высокого давления особенно отчетливо выступил в работе Rutberg (1964) с лизогенной культурой Е. coli К39. После пятиминутного воздействия давления 1040 атм при 37° на эту культуру, титр фага ламбда, продуцируемого ею, не менялся в течение часа, а затем резко стал повышаться, достиг­ нув ІО8 против исходного титра ІО4. В контроле, не находив­ шемся под давлением, за время опыта концентрация фага до­ стигла лишь 10е (рис. 25).

более низких давлениях —в пределах от 890 до 290 атм. Слабое индуцирующее действие было отмечено даже при 150 атм. В этих опытах при данном давлении число индуцируемых бактерий про­ порционально возрастало со временем экспозиции под давлением. Авторы отмечают, что как при температуре 37°, так и при 30° скорость индукции возрастала экспоненциально с повышением давления от 250 до 900 атм.

В дальнейшем выяснилось (Rutberg, 1965), что после пребы­ вания под давлением 720 атм - в течение 4 мин. и добавления хлорамфеникола клетки теряют иммунитет к суперинфекции гомологичным фагом. Автор предполагает, что давление инду­ цирует образование фага у этого штамма кишечной палочки, воздействуя на иммунитет клеток.

По данным Раутенштейна и Мурадова (1966), высокое давле­ ние вызывает хорошо выраженный индуцирующий эффект при воз­ действии на споры полилизогенной культуры Actinomyces Іеѵоris 2638. Наибольшее число корпускул фага наблюдалось после пребывания спор под давлением 700 атм в течение 30 мин., наи­ меньшее — под1давлением 200 атм. Значительно слабее был выражен процесс индукции актинофага высоким давлением у лизоген­ ной культуры Actinomyces olivaceus: титр фага, если и воз­ растал под давлением 700 атм, то только на один порядок вели­ чин (табл. 12).

44

В работе приводятся также данные тех опытов, в которых объектом для получения индуцирующего эффекта служил мице­ лий 6-, 12-, 18- и 24-часового возраста. Эти опыты показали, что под давлением 700 атм из мицелия образуется меньше зре­ лых частиц фага, чем из спор, причем с увеличением возраста мицелия он становится менее чувствительным к индуцирующему влиянию высокого давления.

Авторы обращают внимание на тот факт, что относительно барорезистентные актинофаги образуются после действия давле­ ния на полилизогенную культуру Act. levoris в большем коли­ честве, чем фаги, чувствительные к нему.

ДЕЙСТВИЕ НА ВИРУСЫ РАСТЕНИЙ

Первое сообщение об инактивации растительных вирусов под высоким давлением содержится в работе Gidditigs, Allard а. Hite (1929). Сок из растений, пораженных вирусом табачной мозаики, подвергали действию высокого давления и затем вводи­ ли в растения табака.

Т а б л и ц а 13. Инактивирующее действие высокого давления на вирус табачной мозаики (Gicldings et al., 1929)

Как видно из табл. 13, все 20 растений, которым не вводили сок больного растения, остались здоровыми. У 26 растений из 30, инфицированных соком, оставшимся при атмосферном давле­ нии (контроль), так же как у 31 растения из 40, зараженных соком, находившимся под давлением 75 000 ф/д25—7 дней, вско­ ре появились явные признаки мозаичной болезни.

Инактивация вируса табачной мозаики произошла лишь под давлением 130 000—200 000 ф/д2. Ни у одного растения из 130, ннокулированных содержащим вирус соком после пребывания его

46

под этим давлением, не наблюдалось симптомов заболевания мо­ заикой.

По данным Basset, Gratia, Macheboeuf et Manil (1938), очищенный вирус табачной мозаики сохранял в значительной степени свою вирулентность после пребывания в течение 45 мин. под давлением 2000, 4000 и 6000 атм. Также мало отличалась от контроля способность вируса к кристаллизации и к осажде­ нию в смеси со специфической к нему антисывороткой. Давле­ ние 8000 атм уже заметно влияло на эти свойства вируса табач­ ной мозаики.

Вирулентность неочищенного вируса табачной мозаики оказа­ лась более устойчивой к высокому давлению, чем у неочищен­ ного вируса некроза табака. Последний полностью терял свою активность под давлением 5500 атм, тогда как на листьях число мозаичных пятен, вызванных инокуляцией ВТМ, после действия на пего давления 8000 атм только на одну треть было меньше, чем в контроле. Данные по влиянию высокого давления на ак­

Lauffer a. Dow (1941) поместили очищенный вирус табач­ ной мозаики на 45 мин. под давление от 5000 до 10 000 атм и обнаружили, что коагуляция вируса достигала наибольшего процента после пребывания под давлением 6460 и 7510 (табл. 14). При меньшем или большем давлении коагуляция была выражена слабее. Между тем в опытах с давлением 6460 атм сохранялось еще 10% активности вируса и она практически отсутствовала в малокоагулировапиых препаратах вируса, пробывших под давле­ нием 8500 и 10 000 атм.

-47

Из табл. 14 также видно, что удлинение времени действия около 7500 атм с 45 мин. до 4 час. приводит к коагуляции до 85% вируса табачной мозаики. Характер кривой денатурации вируса с возрастанием продолжительности действия этого дав­ ления указывает на то, что данный процесс является реакцией первого порядка.

Авторы отмечают малое содержание фосфора в коагулятах вируса табачной мозаики, которые образуются после давления

Рис. 26. Скорость денатурации ви­ руса табачной мозаики после нагре­ вания при 68,8° при повышенном давлении (в ф/д2) (Johnson et al., 1948)

1 — 14,7;

2 — 2500;

3 — 5000;

7 — 7000; S — 10 000

6000—8000 атм,— обстоятельство, свидетельствующее об освобож­ дении нуклеиновых кислот при денатурации вируса высоким давле­ нием.

Давление способно задержать тепловую денатурацию вируса табачной мозаики. В опытах Johnson, Baylor a. Fraser (1948) четырехчасовое нагревание вируса при температуре 68,8° в усло­ виях атмосферного давления приводило к выпадению в осадок 85% вируса. Между тем прп той же температуре и продолжи­ тельности нагревания, но под давлением 680 атм, в растворе оставалось 85% вирусного белка (рис. 26).

ДЕЙСТВИЕ НА ВИРУСЫ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

Исследования устойчивости вирусов животных и человека к высокому давлению были начаты Basset, Wollman, Macheboeuf

экспозиции под давлением 4500 атм.

•В последующих опытах (Basset, Nicolau, Macheboeuf, 1935) испытывалось действие высокого давления на вирусы бешенства, герпеса, желтой лихорадки, ящура и на вирус, вызывающий бо­ лезнь Борна. Эти вирусы полностью или частично сохраняли свою вирулентность после 30-минутного пребывания под давле­

48

нием 2000 атм. Вирус герпеса полностью инактивировался при той же экспозиции под давлением 3000 атм, вирус ящура — под давлением 4000 атм, вирус бешенства — под давлением 5000 атм и вирус болезни Борна — под давлением 7000 атм. Вирус желтой лихорадки, в опытах с которым авторы ограничились давлением 3000 атм, ослаблялся после выдерживания под этим давлением.

Вирус чумы птиц разрушался через 30 мин. под давлением 4000 атм (Lepine et al., 1936). Если свежим вирусом заража­ лись птицы, которым иа 20—30 дней раньше вводили вирус, бывший под давлением 4000 атм, то они погибали, но па 24— 48 час. позднее контрольных. Очевидно, в слабой степени сохранились антигенные свойства вирусного белка после давле­ ния.

Curtis, Smith, Brown, Beard a. Eadie (1958) подвергали дав­ лению 2000 атм продолжительностью 24 часа при —20е вирус, вызывающий гепатит у мышей, и вирус птичьего эритробластоза. Животные не заболевали, когда им вводили вирусы, пробывшие под давлением, тогда как зараженные нативным материалом жи­ вотные погибали. Выяснилось также, что куры, оставшиеся здо­ ровыми после введения вируса птичьего эритробластоза, подвер­ гавшегося компрессии, погибали, если через шесть недель они заражались вирусом из контроля.

Опыты Basset, Lepine et Chaumont (1956) с вирусом полио­ миелита, которые были проведены на мышах, показали, что в пределах давления 2000— 12000 атм патогенность его уменьшает­ ся после давления 4000—8000 атм, ио вирус сохраняет частично свои антигенные свойства. Выяснилось далее, что при низкой температуре требуется меньшее давление для инактивации вируса

T а б л и ц а 15. Влияние высокого давления (в ф/д2) на гемоагглютннирукнцую способ­ ность вируса гриппа при температурах —22 и —12° (Overman, Lewis, 1959)

* Титры, эквивалентные титрам вируса, не подвергавшегося давлению.

49