книги из ГПНТБ / Крисс А.Е. Жизненные процессы и гидростатическое давление

МУТАГЕНЕЗ В УСЛОВИЯХ ДАВЛЕНИЯ

Высокое давление может оказывать влияние на п р о ц е с с м у т а г е н е з а , вызываемый горчичным газом. В опытах МсЕІгоу а. de la Haba (1949) повышение давления до 9000 ф/д2 в сус­ пензии конидий Neurospora crassa, обработанной горчичным газом,

давления и степенью ингибирования индуцирующего эффекта

ли лишь 10%)- Выраставшие мутанты не отличались от мутантов, которые возникали под действием горчичного газа в условиях атмосферного давления.

Процент снижения числа морфологических мутантов можно было уменьшить, если давление использовалось не одновремен­ но, а спустя 10 — 15 мин. после отмывки конидий от горчичного газа и ресуспендирования их в фосфатном буфере. В этом слу­ чае количество мутаций уменьшалось по сравнению с контро­

Противоположное влияние оказывало высокое давление на процесс образования биохимических мутантов. Число их не толь-

126

ко не уменьшалось, но даже увеличивалось, когда конидии Neurospora crassa подвергались комбинированному действию гор­ чичного газа и давления 9000 ф/д2 (табл. 48). Таким образом было подтверждено предположение о существовании двух типов мутантов, отличающихся по своей природе.

В последующих исследованиях МсЕІгоу (1952) определял дей­ ствие давления (10 000 ф/д2) на конидии Aspergillus terreus после облучения ультрафиолетовыми лучами. Результаты полу­ чались противополояшыми, в зависимости от дозы ультрафиоле­ товой радиации. При дозе, обеспечивающей выживание конидий в количестве более 5%, давление заметно уменьшало число морфо­ логических мутаций, тогда как при большей интенсивности ра­ диации (меньше 5% выживаемости) давление увеличивало часто­ ту мутаций (табл. 49).

127

Стимулирующий эффект давления особенно проявился во вза­ имодействии с двумя мутагенными факторами — горничным га­ зом п ультрафиолетовой радиацией. При определенных дозах этих факторов количество мутаций у Aspergillus terreus явно возросло под давлением 10000 ф/д2.

Изменение температурных условий также влияло на индуци­ рующее действие горчичного газа под давлением: при 10° дав­ ление 10000 ф/д2 ингибировало мутагенез почти наполовину, а при 25° количество мутаций было таким же, как в контроле при атмосферном давлении.

По данным Palmer (цит. по ZoBell, 1964), давление 300 атм способствовало образованию биохимических мутантов у Serratia marinorubra. По сравнению с атмосферным давлением число мутантов увеличивалось в несколько сот раз.

ВЛИЯНИЕ ДАВЛЕНИЯ НА ОБМЕН ВЕЩЕСТВ У МИКРООРГАНИЗМОВ

МЕТАБОЛИЗМ ГЛЮКОЗЫ

Первые сравнительные исследования метаболизма глюкозы под давлением в несколько сот атмосфер и прн атмосферном дав­ лении у Pseudomonas (Bacterium) desmolyticum, баротолерантиой фюрмы, выделенной из ила Тихого океана на глубине 4560 м, показали (Чумак, 1959; Крисс, Чумак, 1964), что наблюдаются заметные сдвиги в процессе сбраживания глюкозы под высоким давлением.

Развиваясь в течение 72 час. под давлением 500—550 атм, бактериальные клетки потребляли глюкозу в значительно боль­ шем количестве, чем при атмосферном давлении (табл. 50). Из этой таблицы видно, что 1 млн. клеток в условиях давления 500 — 550 атм ассимилировал 17,0 мкг глюкозы, т. е. в два раза больше, чем при 1 атм; соотношение увеличилось с повышени­ ем давления до 750 атм. В опытах, где добавляли мел, вслед­

500 атм коснулись не только потребления, но и выхода продук­ тов брожения. Вначале было отмечено резко пониженное обра­ зование углекислоты — на среде с пептоном в шесть раз мень­ шее, чем при атмосферном давлении (табл. 50). Данное явление повторилось и после замены пептона неорганическим азотом в виде фосфорнокислого аммония, которая была сделана нз опасе­ ния, что бактерии могут использовать углеродный скелет амино­ кислот пептона в качестве источника углерода.

128

Т а б л и ц а 50. Влияние давления на потребление глюкозы и образование СО. pseudomonas (Bacterium) desmolyticum. (Крисе, Чумак, 1964)

П р и м е ч а и и е. Под давлением 500 атм мел оставался лежать иа дне оаллона плотной массой. Начальная концентрация бактериальных клеток составляла 1,0—2,5 млн/мл, продолжительность опытов — 72 часа, температура культивирования — 28". Цифры в скобках — число опытов, из которых приведены средние данные.

Если в отношении углекислоты наблюдалось ингибирующее действие высокого давления, то иные результаты были получе­ ны для органических кислот, накапливающихся в культуральной жидкости. Данные по влиянию давления иа образование орга­ нических кислот при сбраживании глюкозы Pseudomonas (Bac­ terium) desmolyticum представлены ниже. Исходное количество глюкозы составляло 10 г/л, продолжительность опытов — 72 часа, температура культивирования — 28°.

П р и м е ч а н и е . Цифры в скобках —число опытов, из которых приведены средние данные.

В этих опытах на среде с пептоном за 72 часа при атмосфер­ ном давлении потреблялось в среднем 151,2 мг глюкозы на 100мл среды, а под давлением 500 атм — 77,7 мг. В первом случае об-

разовывалось 5,1 мл кислоты, а во втором — 4,8 мл, т. е. ве­ личины одного порядка.

Однако, учитывая меньшее потребление глюкозы в условиях высокого давления, стало очевидным, что при 500 атм органи­ ческих кислот накапливается больше в пересчете на использо­ ванный сахар. На 1 г потребленной глюкозы при атмосферном давлении образовалось в среднем 36 мл кислоты, а под давлением 500 атм — 64 мл. Та же закономерность сохранилась в опытах,

где вместо пептона применяли минеральный азот в виде фосфор­ нокислого аммония: продукция нелетучих кислот увеличивалась вдвое с повышением давления до 500 атм.

Что же касается летучих кислот, то они в расчете на 1 г глюкозы также вырабатывались в количестве, вдвое превышаю­ щем при 500 атм количество их при атмосферном давлении. Рнс. 75 дает представление о сдвигах в метаболизме глюкозы, которые наступали тогда, когда рост и размножение Pseudomo­ nas (Bacterium) desmolyticum происходили не при атмосферном давлении, а в условиях давления 500 атм. Вместо преимущест­ венного образования углекислоты при одной атмосфере высокое давление приводило к увеличению выхода органических кислот и лишь к незначительному образованию СОг-

Разделение летучих и нелетучих кислот хроматографическим методом показало, что первые представлены муравьиной и уксус­ ной кислотами, а нелетучие — молочной и янтарноіі. Данные об их количествах, за исключением янтарной кислоты, пятна кото­ рой не удалось полностью отделить от пятен молочной кислоты, представлены в табл. 51.

В среднем количество муравьиной и уксусной кислот, нако­ пившееся в культуральной жидкости за 72 часа под давлением 500 атм, было в два-три раза выше, чем в контроле при ат­ мосферном давлении. Молочная кислота образовывалась примерно

130

в равном количестве в условиях высокого и нормального дав­ ления.

Следующим этапом было выяснение характера изменений в метаболизме глюкозы у Pseudomonas sp. штамм 8113 в за­ висимости то величины давления (Крисс и др., 1967). Этот вид бактерий, выделенный из ила Черного моря на глубине 1900 м, был избран в качестве объекта исследования вследствие того,

что он не только размножался под давлением в несколько сот атмосфер, но и проявлял барофильные свойства, накапливая в определенных условиях большую биомассу под высоким давлени­ ем, чем при 1атм.

В пределах величин давления, когда Pseudomonas sp. ста­ новился барофильиым (до 350 атм), потребление глюкозы бак­ териальными клетками уменьшалось с повышением давления. Наи­ меньшее количество глюкозы (5,2 мгк/млн клеток) ассимили­ ровалось под давлением 350 атм, которое способствовало наи­ большему выходу бактериальной массы.

Потребление глюкозы Pseudomonas sp. при разной величине дав­ ления показано нише- (Крисс и др., 1967). Исходное количество бактериальных клеток составляло 2,5 млн/мл, продолжительность опытов — 96 час., температура культивирования — 28°.

Давление выше 350 атм было неблагоприятным для размно­ жения Pseudomonas sp. При 500 атм бактериальная масса на­ растала в меньшем количестве, чем при атмосферном давлении. В культуре значительное число клеток было представлено в виде нитей различной длины, но потребление глюкозы заметно воз­

5* 131

росло, достигнув 6,3 мкг/млн клеток. Более высокое давление (540—575 атм), сильно угнетавшее не только размножение, но и рост бактерий, вызвало увеличение количества ассимилирован­ ной глюкозы до 6,8мкг/млн клеток.

Если после трехсуточного выращивания Pseudomonas sp. под давлением 500 атм производилась декомпрессия, то потребление глюкозы продолжалось в последующие трое суток, хотя роста культуры не происходило. Интенсивность потребления глюкозы клетками, выросшими под давлением 500 атм, возросла после снятия давления. Через трое суток пребывания в условиях ат­ мосферного давления содержание глюкозы в культурной

продукция летучих кислот возросла на 21%, а при 500 атм и выше — почти вдвое по сравнению с контролем.

Т а б л и ц а 52. Выход летучих кислот, ьтплового спирта и углекислоты (а мг'г потребленной глюкозы) при сбражшшшш глюкозы Pseudomonas sp. в загнсимости от величины давления (Крпсс и др., 1067)

Давление 25 — 100 атм способствовало некоторому увели­ чению Еыхода этилового спирта, а затем (при 200 и 350 атм) концентрация его в среде уменьшалась. Однако под давлением 500 — 575 атм образовывалось на 30 — 90% больше спирта, чем при атмосферном давлении.

Что же касается углекислоты, то количество ее увеличивалось под давлением 50 — 100 атм, после чего снижалось, уменьшаясь вдвое и втрое при 560 и 574 атм по сравнению с контро­ лем.

132

Сопоставление всех данных показывает, что Pseudomonas sp. под давлением, при котором проявляется барофильиость этого вида, полнее использует глюкозу, чем при большем давлении, уже угнетающем его размножение. Как видно из рис. 77, высо­ кий урожай клеток при оптимальном давлении сопровождался снижением интенсивности потребления глюкозы; при этом воз­ растало количество выделяемой углекислоты.

Давление 500 — 575 атм, ингибируя размножение, увеличива­ ло потребление глюкозы бактериальными клетками. В этих усло-

Рис. 76. Потребление глюкозы Pseudomonas sp. штамм 8113 под давлением

500 атм и после одномоментного снижения давленпя до 1 атм (Крпсс и др., 1967)

Рис. 77. Зависимость между числом бактериальных клеток (1), интенсив­ ностью потребления глюкозы (3) и выходом летучих кпслот (2), этилового спирта (4), С02 (5) при выращивании Pseudomonas sp. штамм 8113 под давле­ нием от 25 до 575 атм (Крисс и др., 1967)

133

виях эффективность использования глюкозы резко снижалась, судя по уменьшению выхода СО2 и повышению концентрации менее окисленных продуктов — спирта и летучих кислот. По-видимому, под давлением 500 атм и выше угнетаются некоторые ферменты, участвующие в метаболизме глюкозы, и бактериальным клеткам приходится усиливать потребление ее, чтобы компенсировать недостаток энергии из-за неполного использования сахара.

Аналогичные результаты были получены в нашей лаборатории Блохиной (1971а,б) с галактозой, мальтозой, сахарозой, лакто­ зой и рафпиозой.

Опыты, поставленные по той же методике, что и с глюкозой, показали, что метаболизм глюкозы и галактозы под давлением в несколько сот атмосфер протекает у баротолерантных бактерий сходным образом: при давлении, оптимальном для размножения, потребление углеводов мало отличалось от контроля и значитель­ но увеличивалось при супраоптимальном давлении (500 атм) с вы­ ходом повышенных количеств недоокисленных продуктов, спирта и летучих кислот. Некоторое отличие наблюдалось лишь с лакто­ зой, метаболизм которой оказался более чувствительным к давле­ нию (табл. 53). В еще большей степени ингибирующий эффект давления сказался на сбраживании трнсахарида — рафинозы.

Влияние температуры

Эти исследованпя по влиянию высокого давления на метабо­ лизм глюкозы у баротолерантной бактерии Pseudomonas sp. при оптимальной температуре (28°) были продолжены в условиях культивирования этого же штамма при субоптимальных (7,5 и 15°) п супраоптимальной (40°) температурах (Крисс, Коштоянц, 1969).

Потребление глюкозы бактериальными клетками в условиях атмосферного давления увеличивалось на 25% при 15° и удваива­ лось при 40°, если сравнивать с ассимиляцией глюкозы при оп­ тимальной температуре (табл. 54, 55). Повысилась также продук­ тивность бактериальных клеток в отношении образования спирта и летучих кислот при внеоптимальных для размножения темпера­ турах. При атмосферном давлении в расчете на 1 млн. клеток спирта образовывалось на 22%, летучих кислот — на 9% больше при 15°, чем при 28°, а при 40° в 1,5—2 раза соответствеини (рис. 78).

Что же касается выхода спирта на 1 г глюкозы, то сунраоптимальная и субоптимальная (15°) температуры при атмосфер­ ном давлении давали величину меньшую, чем при брожении в условиях оптимальной температуры, тогда как выход летучих кислот на 1 г глюкозы возрастал с повышением темпера­ туры.

134