книги из ГПНТБ / Крисс А.Е. Жизненные процессы и гидростатическое давление

Рис. 60. Влияние давления (ф/д2) на размножение и жизнеспособность клеток Е. coli при разных температурах (Johnson, Lewin, 1946b)

1 — контроль; г — 1000; 3 — 5000 ф/д*

давал видимого роста при 40° в условиях атмосферного давления, однако размножался под давлением 400 и 500 атм. Число клеток нарастало при 20° и 1, 300, 400, 500 и даже 600 атм, но более обильный рост наблюдался при меньших величинах давления, включая атмосферное.

При более низкой температуре, 10°, усиливается ингибирую­ щее размножение или вызывающее гибель клеток влияние вы­ сокого давления (ZoBell, Oppenheimer, 1950). Из табл. 39 видно, насколько меньше был урожай клеток, особенно под давлением

логичных опытах с Е. coli. Было сопоставлено влияние давления 1 и 1000 атм на бактериальные клетки при температурах 20, 30, 40°. С повышением температуры происходило уменьшение числа

П р и м е ч а н и е . Начальная концентрация бактериальных клеток — около 103. Про­ должительность инкубации — двое суток.

ПО

Рис. 6І. Утрата жизнеспособности клеток Е. coli при повышении температу­ ры и давления (ZoBell, Cobet, 1962)

I — 20°,? 1 атм; а — 30°, 1 атм; 3 — 20°, 1000 атм; 4 — 40°, 1 аты; 5 — 30°, 1000 атм; 6 —40°, 1000 атм

Рис. 62. Динамика развития культуры Pseudomonas sp. штамм 8113 при оптимальной, супраоптимальной и субоптимальной температурах и атмос­ ферном давлении (Крисс, Коштоянц, 1969)

и под давлением 1000 атм, но под высоким давлением этот про­ цесс значительно ускорялся (рис. 61). Авторы полагают, что от­ личие этих результатов от предыдущих исследований (Johnson, Lewin, 1946b; Johnson, ZoBell, 1949a) может быть объяснено различиями бактериальных видов и различием в химическом со­ ставе питательных сред.

В наших исследованиях (Крисс, Коштоянц, 1969) наблюда­ лось ослабляющее действие супраоптимальной температуры по сравнению с субоптимальной на эффект давления в отношении урожая клеток Pseudomonas sp. штамм 8113.

111

уже через сутки и далее культура вступала в стационарную фазу. Эта температура способствовала высокому урожаю бакте­ риальной массы — около 700 млн. клеток в 1 мл среды Рана. Супраоптимальная (40°) и субоптимальная (7,5°) температуры

ния на клеточное деление по сравнению с супраоптимальной тем­ пературой (рис. 63).

Т а б л и ц а 40. Влияпие давления на урожай клеточной массы (в %) Pseudomonas sp. штамм 8113 при супраоптиыальпой и субоптиыальной для размножеппя температурах (Крисс, Коштоянц, 1969)

б — отношение урожая при 40, 15, 75° к урожаю при 28° в процентах.

112

Растворенные в среде газы

Hedeu а. Malmborg (1961) аэрировали суспензии клеток Sta­ phylococcus aureus п Escherichia coli под давлением до 35 атм. Через 3 часа наблюдалась слабая задержка роста по сравнению с контролем при атмосферном давлении, но через 6 час. различия

вмутности были уже значительными. Те же результаты получены

вопытах с Bact. coli, однако отставание в размножении начи­ налось раньше. При более высоком давлении (65 атм) и аэрации проявлялась тенденция клеток к агглютинации, но подсчет кле­ ток был еще возможным.

под давлением 100 атм приводило к прекращению их размно­ жения, тогда как в условиях этого гидростатического давления,, но при нормальном содержании Ог(<10 мг/мл) они размножа­ лись, как и при 1 атм (ZoBell, Hittle, 1967). Увеличение ко­ личества кислорода выше нормы приводило не только к утрате способности к размножению этих видов, а также Serratia шаrinorubra и Pseudomonas eualia при повышенном гидростати­ ческом давлении, но и к гибели клеток, между тем при атмо­ сферном давлении обогащение среды кислородом не оказывало вредного влияния.

Введение в питательную среду ксенона, аргона, моноокиси азота, азота под давлением до 41 атм замедляло размножение клеток Streptococcus faecalis в следующем порядке: ксенон и моноокись азота>аргон>азот; гелий не давал видимого эффекта (Fenn, Marquis, 1968). Гидростатическое давление 41 атм в от­ сутствие инертных газов также ингибировало размножение стреп­ тококка, но в меньшей степени, чем с этими газами.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ, ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ И ХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В КЛЕТКАХ, ВЫЗВАННЫЕ ДАВЛЕНИЕМ

Морфология

Luyet (1937b) описал морфологические изменения в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae, пробывших две минуты под давлением 4800 и 6000 атм. За этот срок давление 4800 атм вы­ зывало гибель примерно 20% клеток, а 6000 атм — 75% клеток.

Мертвые клетки имели меньший размер, чем живые; пер­ вые — 4,6 мк по длинной оси и 3,6 мк по короткой, тогда как живые — соответственно 5,1 и 4,2 мк. Целостность клеточной стенки не была нарушена у погибших клеток, на темном фонелегко прослеживались ее контуры, разрывы не наблюдались и содержимое клеток вне их не обнаруживалось.

113

Количество гранул в протоплазме клеток, погибших под дав­ лением 4800 атм, возрастало, и размеры их были меньше, чем в живых клетках, остававшихся при атмосферном давлении. Та­ кие же результаты получали под давлением 6000 атм, за исклю­ чением того, что гранулы имели более крупные размеры и обра­ зовывали иногда сеть. При сравнении погибших и выживших клеток из одной и той же культуры выяснилось, что те и дру­ гие содержали примерно одинаковое число гранул (мертвые клет­ ки определялись по окрашиваемости в синий цвет метиленовой синью).

Микроскопическое изучение культур морских бактерий, раз­ вивавшихся под давлением 400 и 600 атм, показало (ZoBell, Oppenheimer, 1950), что у ряда видов появлялись нитевидные клетки различной длины. Клетки Micrococcus aquivivus увели­ чивались в размерах и образовывали большие скопления, не­ нормально удлиненные клетки обнаруживались после давления в культурах Bacillus borborokoites, Вас. abysseus, Vibrio phytoplanktis.

У Serratia marinorubra наблюдали также плеоморфизм кле­ ток и гранулярные структуры в цитоплазме (Oppenheimer, Zo­ Bell, 1952).

Авторы описывают картину морфологических изменений кле­ ток этого вида. В условиях атмосферного давления этот вид был представлен палочковидными формами 0,6 — 1,5 мк в длину и 0,3 — 0,5 мк в ширину. На той же питательной среде, но после давления 600 атм, возникали нити без признаков деления, длипой до 200 мк. После декомпрессии они начинали в течение нескольких минут распадаться на короткие палочки, идентич­ ные нормальным клеткам данного вида; процесс расчленения за­ нимал 1—2 часа при температуре 25°.

Образование нитевидных клеток у Pseudomonas perfectomarinus и Е. coli описал Berger (1959). Под давлением 50 — 150 атм они достигали до 100 мк длины. При более высоком давлении, 200 — 400 атм, нити были короче и варьировали по своей толщине, до 10 мк в диаметре, клетки больших размеров часто лизировались.

Образование нитей под давлением в культурах Е. coli также наблюдали ZoBell a. Cobet (1964). Они исследовали три штамма этого вида — В, S, R4. У первого появлялось много нитей, и они имели наибольшую длину, а последний отличался наименьшей способностью образовывать нити (табл. 41). Фрагментация нитей происходила через час или два после декомпрессии, этот процесс охватывал лишь некоторую часть их из числа возникших под давлением. Чаще фрагментация начиналась около концов нитей, но распад имел место также в различных отрезках нити. Ни в одном случае фрагментация не приводила к образованию клеток нормальной длины.

114

и давлении 475 атм, делили на три фракции: первую сразу вы­

ций определяли количество белка. Из табл. 42 видно, что только в третьей фракции число колоний увеличилось примерно в 10 раз. и возросло количество белка.

и1 атм

Пр и м е ч а н и е . Определения были проведены с клетками, которые вначале инку­ бировали при 475 атм и 30° в течение 124 час., после чего фракции II и III вторично, инкубировали.

Свозрастанием давления увеличивался процент клеток в куль-_ туре Pseudomonas sp. штамм 8113, длина которых превышала среднюю длину клеток, выросших в условиях атмосферного дав­ ления (Мицкевич, Крисс, 1966). Удлинение клеток в 1,5—2 раза, наблюдалось уже в трехчасовой культуре. По-видимому, высокое давление в определенных пределах может оказывать стимулирую­

щее влияние на процесс роста бактериальных клеток, не угне-.

тая заметным образом их способности к размножению. Даль­ нейшее повышение давления приводило уже к торможению раз­ множения и резкому повышению процента нитевидных клеток (см. табл. 34).

При более углубленном изучении этого явления были обна­ ружены новые стороны его (Крисс, Мицкевич, 1967).

При микроскопировании культур штамма 8113, выросших на среде Рана под давлением 500 атм, в отличие от культуры, полученной при атмосферном давлении, наблюдался значитель­ ный полиморфизм клеток. Наряду с обычными палочковидными клетками длиной 0,6 — 2,5 мк встречались нитевидные формы, длина которых колебалась между 5 и 80 мк. Если рассматри­ вать эти нитевидные формы как растущие клетки, но утратив­ шие под высоким давлением способность к размножению, а боль­ шинство палочек нормальной длины — как клетки, сохранившие способность к делению, то соотношение нитевидных и палочко­ видных форм может дать представление о степени влияния вы­ сокого давления на очень чувствительную к внешним воздей­ ствиям функцию размножения у бактерий.

Выяснилось, что соотношение нитевидных и палочковидных форм меняется в зависимости от состава питательной среды, когда баротолерантный штамм 8113 культивируется под давле­ нием 500 атм (табл. 43). На среде Рана отношение числа ни­ тевидных клеток к числу клеток нормальной длины равнялось в

себя наиболее благоприятной в отношении урожайности штамма

Pseudomonas sp. штамм 8113, выращенных на разных средах под давлением 500 атм

П р и м е ч а н и е . Продолжительность опытов — двое суток, температура — 28, 29°.

116

массы возникла в результате роста клеток, а не размножения. На глюкозо-пептонной среде, где прирост хотя и уступал урожаю на среде Рана, но все же был достаточно велик, клетки по длине почти не отличались от клеток, характерных для размно­ жающейся культуры при атмосферном давлении. На среде Адам­ са клетки, сохранившие пролиферационную способность, увели­ чивались в своей массе в большей степени за счет удлинения, чем в результате нормального деления.

Более наглядно различия в длине бактериальных клеток (поперечник не изменялся) на разных средах под давлением 500 атм проявились в следующем опыте. Сразу же после из­ влечения баллонов, в которых под давлением культивировали штамм 8113 на соответствующих средах в течение 72 час., пи­ петкой отбирали небольшое количество суспензии бактерий и на­ носили ее на предметное стекло. Суспензию фиксировали в парах 40%-ного формалина, окрашивали карболовым генциановым фио­ летовым и высушивали. Затем с объективом 90 X фотографиро­ вали 10 полей зрения и на микрофотографиях измеряли дли­ ну клеток. Процентное соотношение клеток различной длины на разных средах показано на рис. 64.

Как видно из рисунка, на глюкозо-пептонной среде после культивирования под давлением 500 атм содержание бактери­ альных клеток того же размера, что и в культуре, выра­ щенной на этой среде в условиях атмосферного давления, было очень высоким.

бактерий была представлена нитями, наибольший процент кото­ рых имел длину 10— 20 мк.

Таким образом, состав питательной среды не только опреде­ ляет величину урожая баротолераитных бактерий под высоким гидростатическим давлением, но и заметным образом влияет на устойчивость к действию высокого давления таких важнейших функций бактериальной клетки, как рост и размножение.

Ультраструктура

Электронномикроскопические исследования клеток Pseudomo­ nas sp. штамм 8113, подвергавшихся высокому давлению, были проведены Криссом, Мицкевич и Черни (1969).

При атмосферном давлении клетки из суточной и двухсуточ­ ной культур Pseudomonas sp. штамм 8113, выращенных при ат­ мосферном давлении, имеют складчатую клеточную стенку, со­ стоящую из двух темных слоев толщиной 25 — 30 А каждый, разделенных светлым пространством шириной 30 Â. От цитоплаз­ матической мембраны ее отделяет гомогенный слой умеренной плотности, толщиной 50 — 100 Â (рис. 65).

117

Рис. 64. Процентное соотно­ шение клеток различной дли­ ны в культурах Pseudomonas sp. штамм 8113, выращенных на разных средах под давле­ нием 500 атм (Крисс, Миц­ кевич, 1967)

а — на среде Рана; б — па среде Адамса; е — на среде Зобелла

Цитоплазматическая мембрана также имеет трехслойную структуру, однако она несколько тоньше, чем трехслойная структура клеточной стенки.

Цитоплазма клеток содержит многочисленные плотные гра­ нулы — рибосомы, которые часто располагаются группами во­ круг ядерного компонента. Особой упорядоченности в располо­ жении полирибосом не отмечено. Немногочисленные интрацито-

Рис. 65. Клетка из двухсуточной культуры Pseudomonas sp. штамм 8113, выращенной при атмосферном давлении (Крисс, Мицкевич, Черни, 1969)

Клеточная стенка (КС) состоит из сильно извитой трехслойной мембраны и гомогенного промежуточного слоя умеренной плотности (ПС); ЦМ — цитоплазматическая мембрана;. ИМС — интрацитоплазматнческая мембранная система:^ — рибосомы, х 123[000

Рис. 66. Нитевидная клетка из двухсуточной культуры IPseudomonasJsp. штамм 8113, выращенной под давлением 350 атм (Крисс, Мицкевич, Черни,. 1969)

Видно отхождение клеточной стенки от цитоплазматической мембраны и образованиемежду ними светлого промежутка шириной 120—200 Â (стрелка). Клеточная стенка (КС) слабо извита. Н — нуклеоид; Р — рибосомы. На некоторых участках клеточная: стенка утолщена и как бы «равволокняется» (двойная стрелка). X 54 000

Рис. 67. Фрагмент нитевидной клетки на третьи сутки роста при давлении 450 атм (Крисс, Мицкевич, Черни, 1969)

Видно нарушение гомогенности в промежуточном слое клеточной стенки, где ясноГразличается чередование темных и светлых участков (стрелки). X 168 000. Инвагинаций цитоплазматической мембраны (ИНВ в пространство между клеточной стенкой и цито - плазматической мембраной

118

Рис. 66