1.4. Методы оценки признаков поведения (поведенческое фенотипирование).
Прежде чем приступить к селекции по поведенческому признаку, исследователь решает вопрос о выборе подходящего признака поведения, способа его оценки и метода отбора. Надо учитывать, что чаще всего признаки поведения относят к категории количественных и они подвержены влиянию множества средовых и генетических факторов, а методика измерения признака должна быть надежной и нетрудоемкой.
В этом разделе представлены наиболее известные методы оценки признаков поведения у модельных генетических объектов. Ряд методик, использующихся в генетике поведения, будут описаны в главах, посвященных генетике поведения отдельных таксономических групп.
При наблюдениях за животными в естественных условиях или при содержании их в клетках для оценки поведения наиболее часто используется регистрация этограмм – запись (зарисовка, фотографирование, видеозапись и т.п.) всей последовательности поведенческих актов и поз животного. На основе этограмм при анализе социального поведения можно составить социограммы – диаграммы, графически демонстрирующие частоты проявления тех или иных актов поведения при общении особей в группах.
Рис. 1.24. Этограмма сигнального поведения каменки-плешанки (Oenanthe pleschanka)
а—г — различные формы территориального и угрожающего поведения самца, д — то же самки; е—и — брачное поведение самца, к — то же самки. Стрелки обозначают одно- или многократные движения головы и крыльев.
Рис. 1.25. Пример социограммы для социальных отношений семейных групп монгольских песчанок. Толщина стрелок пропорциональна числу взаимодействий между особями; направление показывает, кому адресовано действие.
Для объективной количественной регистрации поведения животных используют многочисленные автоматические и полуавтоматические приборы, снабженные специальным программным обеспечением для обработки данных. Разработаны компьютерные программы, оптимизированные для записи и анализа уникальных поведенческих фенотипов. Каждая такая система обладает высокой пропускной способностью, способна осуществлять видеоанализ активности как одного животного, так и целой группы животных в реальном времени. После видеоанализа программы переводят данные в удобный для статистического анализа формат крупноформатной таблицы.
Программы для анализа поведения групп животных используются, например, при оценке ритмов движений животных, включая хаотичность, склонность оставаться близко к стенам или продвигаться ближе к центру клетки, и т.д. Можно также получить детализированную статистику о поведении группы животных, таком как полная средняя скорость, активная средняя скорость, и т.д., а также определить специфические события, происходящие в группе.
Но, несмотря на активное развитие автоматизированных систем регистрации и учёта признаков, не утратили своей научной ценности приборы и тест-системы, разработанные на более ранних этапах становления генетики поведения. Так, например, в поведении дрозофилы наибольшее внимание уделялось половому поведению, фото- и геотаксисам, а также двигательной активности.
Наиболее изящные методы измерения признака разработаны для таксисов. Прибор для оценки геотаксиса предложен в пятидесятые годы Хиршем. Он состоит из отдельных Т-образных блоков, имеющих один центральный тоннель и два боковых переулка. Блоки расположены рядами, причем в каждом последующем ряду число блоков увеличивается на единицу. Таким образом, вход в лабиринт один, а выходов в десятирядном лабиринте — одиннадцать.
Рис.1.25. Лабиринт для изучения геотаксиса
Используют и более удлиненный вариант лабиринта с 15 рядами и 16 выходами. Лабиринт ориентирован вертикально. Насекомому при прохождении каждого блока предоставляется возможность выбрать направление движения, т. е. подняться вверх по одному из переулков или опуститься вниз по второму. К движению в направлении выхода мухи стимулируются светом люминесцентной лампы, равномерно освещающей конечные коллекционные трубки, и запахом пищи, находящейся в них же.
При прохождении лабиринта с 11 (или 16) выходами каждая особь минует 10 (или 15) перекрестков, по одному в каждом ряду. Путь в соседние отсеки (равно, как и назад) прегражден воронками, ориентированными соответствующим образом. Одновременно можно испытывать по 200 или 300 особей одного пола. Каждая муха получает индивидуальную оценку в соответствии с номером коллекционной трубки, в которую она попала. В самую нижнюю трубку, обозначенную «0», собираются особи, ни разу не обнаружившие отрицательного геотаксиса, в самую верхнюю трубку, под номером «10», попадают особи, все 10 раз проявившие отрицательный геотаксис.
Существует и иной вариант оценок: особям, собиравшимся в центральную трубку и тем самым совершившим равное число поворотов вверх и вниз, дается оценка 0, все особи, попавшие в трубки, расположенные выше центральной, считаются геоотрицательными, а скопившиеся в нижних трубках — геоположительными. Особи ив крайних трубок получают максимальный балл +5 и —5 или +7,5 и —7,5 (в зависимости от числа финальных трубок).
Лабиринт для оценки фототаксиса построен на аналогичном принципе. Особенностью его является горизонтальная ориентация, а также то, что состоит он не из Т-образных, а из Y-образных блоков, в которых один из боковых переулков освещен, а другой затемнен.
Прибор для «сортировки» мух методом обратного потока состоит из двух групп пробирок, укрепленных в двух штативах, которые можно сдвигать относительно друг друга (Рис. 1.26). Мух помещают в пробирку 0, после этого аппарат ставят вертикально и легким постукиванием сбрасывают их на дно пробирки. Затем всю систему кладут плашмя, так чтобы верхние концы пробирок были обращены к свету (а). Мухи, обладающие фототаксисом, движутся к свету, а другие остаются в темном конце (б). Через 15 с обращенный к свету (на рисунке — верхний) ряд пробирок сдвигают вправо (в) и снова стряхивают мух вниз (г). При этом мухи, реагировавшие на свет, попадают в пробирку 1. Верхний ряд пробирок сдвигают влево (д) и после перемещения системы в горизонтальное положение дают возможность мухам, проявившим фототаксис, снова бежать к свету. Процедуру повторяют 5 раз. В результате наиболее активные мухи оказываются в пробирке 5, несколько менее реактивные — в пробирке 4 и т.д.
Рис. 1.26. Прибор для «сортировки» мух методом обратного потока
Для измерения особенностей полового поведения и уровня локомоторной активности обычно прибегают к прямым визуальным наблюдениям. Мух для испытаний рассаживают парами или целыми группами. Половую активность измеряют либо латентным временем до начала копуляции, либо частотой спариваний в определенный срок. Для самцов установлена высокая корреляция между этими двумя способами оценки, равно как и с их общей плодовитостью. Продолжительность копуляции, по всей видимости, является самостоятельным признаком и с уровнем половой активности постоянной связи не имеет. Скорость спариваний учитывают при объединении виргинных (т.е.неоплодотворенных) самок и самцов индивидуальными парами или более многочисленными группами. В последнем случае создают ситуацию либо мужского выбора — один самец среди нескольких самок, либо женского, либо обоюдного — по несколько пар вместе.
Поведенческие признаки, в отличие от морфологических, подвержены влиянию самой обстановки проведения эксперимента. Например, показано, что половая активность зависит от численного состава испытуемой группы. По-видимому, для проявления максимальной половой активности существует оптимальная плотность, так как активность снижается при повышении численности группы и при ее уменьшении. Половая активность самцов зависит от числа доступных самок. В гетероморфной группе половая активность самцов зависит от частоты встречаемости их генотипа, причем преимуществом обладают редкие формы. На половую активность мух влияют условия их личиночного развития, характер освещения до начала эксперимента.
Двигательную активность изучают с помощью приборов разного типа: открытое пространство, или арена, расчерченная на квадраты; кольцевая «беговая» дорожка, размеченная на участки, система камер, соединенных узкими переходами (Рис. 1.27., Рис.1.28).
Рис.1.27. Круговая дорожка для наблюдения за двигательной активностью дрозофил (по Connolly, 1966).
Рис. 1.28. Прибор для массовых испытаний двигательной активности дрозофил. Система камер, расположенных в ряд (1—6). Стартовая камера (1) отделена от остальных задвижкой. Шесть рядов камер смонтированы вместе для параллельного наблюдения за 6 особями или 6 группами.
При этом камеры могут располагаться в один ряд, линейно или тройками вокруг центрального сосуда. Система камер, расположенных в ряд (Рис.1.28. 1—6). Стартовая камера (1) отделена от остальных задвижкой. Шесть рядов камер смонтированы вместе для параллельного наблюдения за 6 особями или 6 группами.
Двигательную активность оценивают числом квадратов, линий или камер, которые особь пересечет за определенное время, а при массовых тестах — долей особей, переселившихся из стартовой камеры в соседние. Длительность испытаний, как правило, варьирует в пределах 1—25 мин. При продолжительных 6—24 часовых массовых испытаниях изучаемую активность называют дисперсионной, или миграционной. При этом испытание проводят как на свету, так и в полной темноте.
Простой метод оценки общей локомоторной активности предложен Е. М. Лучниковой. Заключается он в подсчете числа активных в данный момент (или неактивных) особей из десяти, находящихся в пробирке. Объективность такого метода доказана эффективностью отбора.
Абиотические условия эксперимента могут играть в опытах по генетике поведения существенную роль. Так, генетическая изменчивость по миграционной активности лучше выявляется на свету, но не в темноте. Продолжительность испытательного срока (1 час или 7 дней) влияла на генетическую архитектонику рецептивности самок дрозофилы к самцам yellow: с увеличением длительности испытания увеличивалось влияние на рецептивность аддитивной компоненты взаимодействия генов.
При использовании метода «лабиринта» подопытному животному ставится задача нахождения пути к определенной, непосредственно не воспринимаемой им «цели», которой является чаще всего пищевая приманка, но может быть и убежище («дом») или другие благоприятные условия. При отклонении от правильного пути в отдельных случаях может применяться наказание животного.
В простейшем виде лабиринт имеет вид Т-образного коридора или трубки. В этом случае при повороте в одну сторону животное получает награду, при повороте в другую его оставляют без награды или даже наказывают. Более сложные лабиринты слагаются из разных комбинаций Т-образных (или им подобных) элементов и тупиков, заход в которые расценивается как ошибки животного (рис. 1.29).
Рис.1.29. Варианты лабиринтов: а – план первого лабиринта, применявшегося в зоопсихологии (лабиринт Смолла); б – лабиринт из «мостиков»
Результаты прохождения животным лабиринта определяются, как правило, по скорости достижения «цели» и по количеству допущенных ошибок. Метод «лабиринта» позволяет изучать как вопросы, связанные непосредственно со способностью животных к научению (к выработке двигательных навыков), так и вопросы пространственной ориентации, в частности роль кожно-мышечной и других форм чувствительности, памяти, способности к переносу двигательных навыков в новые условия, к формированию чувственных обобщений и др.
Информативным может быть и метод «обходного пути». В этом случае животному приходится для достижения «цели» обойти одну или несколько преград. В отличие от метода «лабиринта» животное в данном случае непосредственно воспринимает объект (приманку), на который направлены его действия уже в начале опыта. Учитываются и оцениваются скорость и траектория передвижения при поиске обходного пути вокруг преграды. В несколько измененном виде Л. В. Крушинский использовал метод «обходного пути» для изучения способности разных животных к экстраполяции.
Метод дифференцировочной дрессировки направлен на выявление способности подопытного животного к различению одновременно или последовательно предъявляемых объектов и их признаков. Выбор животным одного из двух или более предъявляемых объектов вознаграждается (положительная дрессировка), в других случаях одновременно с подкреплением правильного выбора наказывается неправильный (положительно-отрицательная дрессировка).
Последовательно уменьшая различия между признаками объектов (например, их размеры), можно выявить пределы различения (дифференцировки). Таким образом, можно получить сведения, характеризующие, например, особенности зрения у изучаемого вида животных (его остроту, цветоощущение, восприятие величин и форм и т.п.). Этим же методом можно изучать процессы формирования навыков, память животных, способность к обобщению.
Вариантом дифференцировочной дрессировки, применимым лишь к высшим животным, является метод «выбора по образцу». Животному предлагается произвести выбор среди ряда объектов, руководствуясь образцом, который показывается ему непосредственно экспериментатором или в специальном аппарате.
При использовании метода «проблемной клетки» (ящика) перед животным ставится задача или открыть для себя выход из клетки, приводя в действие различные приспособления (рычаги, педали, затворы и т.п.), или же, наоборот, проникнуть в клетку, где находится подкорм, отмыкая запирающие устройства. Иногда применяются и небольшие ящики или шкатулки с затворами, отмыкание которых дает подопытному животному доступ к корму. При более сложной постановке эксперимента все механизмы и устройства действуют лишь в строго определенной последовательности, которая должна усваиваться и запоминаться животным.
Этим методом можно изучать сложные формы научения и моторные элементы интеллектуального поведения животных. Его особенно удобно применять для изучения животных с развитыми хватательными конечностями – крыс, енотов, обезьян и др. Такие эксперименты служат преимущественно для выявления высших психических способностей животных.
Наряду с более или менее сложными экспериментами в зоопсихологических исследованиях важную роль играет анализ обычного, неподкрепляемого манипулирования различными предметами. Такие исследования позволяют судить об эффекторных способностях животных, их ориентировочно-исследовательской деятельности, игровом поведении, способностях к анализу и синтезу.
В 1930-х гг. Американский исследователь Холл разработал тест «Open field» («Открытое поле») для оценки общей (локомоторной) и исследовательской активности. Нарушения двигательной активности лабораторных животных представляют определенный исследовательский интерес; они имеют место у линий мышей, моделирующих болезни Паркинсона (непроизвольное подрагивание конечностей), Хантингтона (нейродегенеративное заболевание), латерального склероза, атаксии, дистонии и пр.
В тесте «Открытое поле» использовалась специальная установка (Рис.1.30) . Она представляла собой арену, поделенную на равные квадраты. В центр помещали животное, регистрировали число пересеченных им в процессе движения квадратов и узнавали пройденное за определенное время (4–10 мин) расстояние. Этот тест активно используется и в настоящее время, в том числе для изучения тревожности, памяти, начального скрининга фармакологических препаратов.
Современная установка для теста «Открытое поле» снабжена фотоэлементами, что позволяет автоматически регистрировать:
исследовательскую и базовую активность животного;
груминг (поведение, направленное на прихорашивание – облизывание, почесывание и т. п.);
вертикальную активность, снижение активности в процессе освоения территории, редкие или стереотипные движения (индикатор нарушений ЦНС);
подсчитывать пропорцию нахождения животного на периферии или в центре арены (как показатель тревожности), демонстрировать траекторию движения и пр.
Рис.1.30. а, 1.30.б. Установки для теста «Открытое поле»
Систему Home cage activity генетики используют для исследования поведения животных в домашней клетке. Она дополняет данные наблюдений в тестах, фокусирующихся на конкретных поведенческих ответах. Современное оборудование снабжено фотоэлементами или видеокамерой, позволяющими снимать и автоматически регистрировать активность животного, трекинг (траекторию движения), среднюю скорость передвижений, время нахождения в пластиковом укрытии, процент времени неподвижности животного, время приема пищи и воды и пр. Система способна снимать данные одновременно с 24–48 клеток.
Создан прибор подсчитывающий число вращений животного за определенный интервал времени (Ротометр) и прибор, оценивающий чувство равновесия, способность животного балансировать на вращающемся барабане (Ротарод). Разработан – прибор, подсчитывающий число вращений животного за определенный интервал времени.
Тест Raised-beam walking – «прогулка по приподнятой перекладине» – используется для оценки равновесия, в тестах на обучение или оценки возрастных изменений. Животное учится путешествовать по перекладине (разной конфигурации и толщины), достигая закрытой (безопасной) платформы. Регистрируются время ходьбы, соскальзывание лап, падения.
Рис.1.30.в. Тест «Прогулка по приподнятой перекладине»
Анализ походки по следам (отпечаткам лап) – Gait analysis system – тест, используемый, в частности, в исследованиях на животных с хирургическими вмешательствами на спинном мозге, при скрининге фармакологических препаратов. Установка представляет собой коридор, по которому животное предварительно обучают проходить. Сравнивают результаты теста до и после оперативного вмешательства, на фоне медикаментозной терапии.
Установка для оценки тремора животных – Tremor monitor – используется при фенотипировании трансгенных животных, анализе нарушений ЦНС, возрастных изменений, в фармакологических исследованиях. Эта установка отличает тремор от стереотипных движений, она снабжена программным обеспечением, представляет результаты в графическом и цифровом форматах.
Разработаны методы и создано оборудование для оценки сенсорных функций у лабораторных грызунов.
Прибор «горячая площадка» – Hot plate – оценивает пороговую чувствительность острой боли. В тесте «отдергивания хвоста» – Tail flick – прибор фокусирует обжигающий луч света на хвосте животного и замеряет латентный период отдергивания хвоста. Установка «стартл-рефлекс» создает любые комбинации звуков, шумов, белого шума, струи воздуха, света и электрических ударов разной интенсивности. Используется для изучения многих свойств ЦНС.
Разработан ряд поведенческих тестов для оценки зрения. Visual cliff apparatus используется для оценки остроты зрения. Двухуровневая установка имеет высокий уступ, на который помещается животное (Рис.1.31). Обрыв закрыт прозрачным оргстеклом. Особи с нормальным зрением затормаживают перед краем и исследуют его перед тем, как двинуться вперед. Слепые и слабовидящие животные пересекают уступ без задержки.
Рис.1.31. Тест для оценки зрения.
Метод Virtual optomotor system основан на оптомоторном рефлексе животного, который заключается в слежении (т. е. поворачивании головы и шеи) за движущимся предметом. В тесте это бегущие серо-белые волны на мониторе компьютера, контрастность которых в процессе тестирования снижается, что позволяет дифференцировать остроту зрения животных (Рис. 1.32).
Рис.1.32. а., Рис. 1.32.б Установки для метода Virtual optomotor system
Оценка функционального состояния ольфакторного анализатора важна при тестировании фармакологических препаратов, при изучении мотиваций и эмоциональной регуляции поведения, поведенческом фенотипировании мутантных линий мышей. Но исследование ольфакторной перцепции не требует специального оборудования. Тесты основаны на поиске или обнюхивании пищевой или другой аттрактивной (например, феромоны) приманки, помещаемой в домашнюю клетку. Регистрируется латентный период обнаружения приманки, время исследования запаха.
Эмоциональное поведение животных исследуется в разнообразных тестах, наиболее старинным из которых является тест «открытого поля», где этот параметр оценивается по числу фекальных болюсов, оставленных животным на арене.
Исследуют и такой поведенческий признак как тревожность. Под тревожностью этологи понимают защитный ответ организма на потенциальное присутствие угрозы (в отличие от страха, вызванного реальным угрожающим стимулом). Физиологические основы страха и тревожности во многом отличаются. Страх является адаптивной реакцией, в то время как повышенная тревожность дезадаптирует организм, вредит ему.
Тревожность подразделяют на конститутивную, во многом генетически закрепленную, и ситуативную, провоцированную условиями теста. Инбредные линии мышей могут отличаться по своему тревожному поведению, которое оценивается по уровню неофобии (боязнь новизны) в ситуации свободного исследования.
Исследования ситуативной тревожности можно разделить на две большие группы:
без обучения (необусловленные)
с обучением (обусловленные модели)
Модели без обусловливания, или этологические, основаны на исследовательской активности животных при наличии природных стимулов, вызывающих чувство страха или тревоги. Например, конфликт между желанием животного остаться в безопасном месте или исследовать новое, но потенциально опасное пространство (ярко освещенное или открытое). Исследовательский ответ животного состоит в осмотре, обнюхивании, подъемах на задние лапы, прыжках, рытье, заглядывании вниз, перемещении доступных объектов. Тревожный ответ – в замирании, поиске убежища, обильной дефекации и уринации.
Тревожность можно изучать в приподнятом крестообразном лабиринте – Elevated Plus Maze, который состоит из двух закрытых (аналог норы) и двух открытых (потенциально опасных) рукавов. Вся конструкция приподнята над полом на 60-70 см и ярко освещена сверху. В тесте измеряют число входов и время, проведенное в открытых и закрытых рукавах; акты заглядывания вниз, вытягивания-принюхивания, задний ход. Более тревожные мыши предпочитают закрытые рукава.
Рис.1.33. Мышь в приподнятом крестообразном лабиринте
В тесте «темно-светлая камера» – Light-dark exploration box, используется установка, поделенная на две части – темную, занимающую 1/3 пространства, и светлую. Животное помещают в светлый отсек и измеряют латентный период первого захода в темный отсек, число перемещений туда–обратно, время, проведенное в светлом и темном отсеках, выглядывание из темного в светлый и число вставаний на задние лапы. Анксиолитики (вещества, снижающие уровень тревоги) увеличивают число переходов между темным и светлым отсеками камеры и другие параметры.
Рис.1.34. а., Рис. 1.34.б. Тест «Темно-светлая камера».
Методы оценки тревожности с предварительным тренингом (обусловливанием) изучают классические условные рефлексы, с отрицательным подкреплением, где вначале нейтральный стимул при повторении становится условным для реализации определенного поведенческого ответа. Например, создают временное сочетание условного стимула (свет, звук) с безусловным (электрический ток). В результате животное при безобидном со стороны стимуле демонстрирует поведение, как будто его ударили током.
Выполнение таких тестов зависит от памяти. Они используются для скрининга анксиолитической или анксиогенной активности фармакологических препаратов, для изучения нейробиологии тревожности, или, например, для оценки опыта раннего детства.
Создано оборудование для формирования обусловленного контекстом страха поведения - Fear conditioning equipment. Оно состоит из звукоизолирующей камеры с полом из металлических прутьев, соединенных с генератором электрического тока, звукогенератора для условных сигналов (ими могут быть и другие стимулы, например один из часто используемых ольфакторных стимулов – запах апельсинового сока).
После обучения в камере у животного имеют место долговременные поведенческие изменения, которые можно изучать генетическими и фармакологическими методами.
Поведенческая модель для исследования активного и пассивного избегания – Active or passive avoidance system – напоминает обусловленный контекстом страх. Животное помещают в клетку (shuttle-box), где после условного сигнала по полу подается электрический ток. В ситуации пассивного избегания (закрытая дверь в безопасный отсек) регистрируют время замирания, в ситуации активного избегания (при открытой дверце в безопасный осек) – латентный период побежки. Коммерческий вариант установки может тестировать одновременно 8 животных.
Ученые исследуют и такой поведенческий признак как депрессия. Депрессия - это психическое состояние с пониженным настроением, сниженной жизнеспособностью, отсутствием стремления к удовольствию (ангедония). Некоторые виды депрессии провоцируются стрессорными жизненными обстоятельствами. Имеет место генетическая предрасположенность к заболеванию депрессией. В 1970–1980-х гг. причину депрессии видели в истощении моноаминовых депо нейронов, в настоящее время исследования молекулярных механизмов депрессии сконцентрированы на выяснении роли ряда транскрипционных факторов.
Депрессивноподобное состояние животных в эксперименте провоцируется длительными стрессорными воздействиями или селекцией. Проверка формирования депрессивноподобного статуса осуществляется в стандартных тестах «принудительного плавания» (Forced swimming test, он же Porsolt test, или «защемления хвоста» (Tail suspension test)
В обоих случаях оценивается время, когда животное от активных попыток освободиться из неприятного положения (погружение в воду или подвешивание за хвост), переходит к неподвижности, зависанию, которое исследователи ассоциируют с потерей животным надежды и поведением отчаяния. Клинически активные антидепрессанты увеличивают время наступления неподвижности.
Ангедония оценивается в тесте на потребление сахара (Sucrose consumption): животным в домашнюю клетку помещают две бутылки – с водой и 5–10 %-м раствором сахарозы. В состоянии депрессии объем выпитого раствора сахарозы в процентном отношении снижен.
Одна из моделей формирования у животных депрессивного состояния называется «обученная беспомощность» (Learned helplessness model). Она разработана около 30 лет назад. Животные сидят в трех одинаковых клетках с прикрепленными к лапам электродами. Контрольному животному ток не подается. В две другие клетки ток подается, однако в первой клетке животное может отключить ток, выполнив инструментальное действие (например, нажав на педаль), т. е. оно находится в состоянии избегаемого стресса. Во второй клетке данное действие не приводит к отключению тока (ток отключается только одновременно с 1-й клеткой), т. е. создается ситуация неизбегаемого стресса. Именно последний тип стресса оказывает наиболее разрушительное влияние на психику, приводя к депрессии.
Модель позволяет оценить профилактический эффект фармакологических препаратов (до стрессорных воздействий) и терапевтический эффект (после возникновения поведенческих нарушений). В первом случае эффективными оказываются препараты анксиолитического ряда, во втором – антидепрессивного.
Интересуют генетиков и стереотипные движения (облизывание, фырканье, мотание головой, вытягивание в одном местоположении, упорное грызение прутьев клетки). Существуют стереотипии, при которых более сложные паттерны поведения (еда, питье, уход за собой и социальное поведение) исчезают.
Стереотипии автоматически регистрируются приборами «Open field system», «Home cage activity system». Большинство движений при стереотипии можно вызвать большими дозами психостимуляторов (кокаин, амфетамин). Эта модель используется для скрининга потенциальных антипсихотических веществ. Исследование стереотипии имеет длинную историю, ранее фокус внимания был сосредоточен на дофаминэргической системе стриатума. Современные исследования связаны с поиском внутриклеточных белков-посредников, участвующих в клеточном метаболизме.
Особенно сложными являются методы и оборудование для оценки когнитивных функций (памяти, обучения и т.п.) .
Для оценки когнитивных функций используется:
радиальный лабиринт – Radial maze, в котором животное выбирает оптимальную стратегию исследования и нахождения пищи (награды) с минимумом усилий;
Т-лабиринт – Т-maze, в котором животное ищет приманку;
тест в водном лабиринте Морриса (Morris water maze), основанный на поиске оптимальной стратегии для избегания воды с минимумом усилий – на поиске кратчайшей дистанции до спрятанной под водой платформы на основании предыдущей памяти о ее местонахождении;
лабиринт Барнеса (Barnes Maze), который позволяет исследовать процессы обучения и памяти, используя пространственную навигацию;
Кроме памяти и обучения к когнитивным процессам относят феномен внимания как селекцию сенсорной информации из среды для последующего стимулсвязанного процессинга. Внимание состоит из нескольких субкомпонентов, включая ориентирование, селективное внимание, длительное внимание (бдительность) и рассредоточенное внимание. Этот феномен также доступен для моделирования на животных.
Разработаны методы и оборудование для исследования социального поведения животных. По определению, социальное поведение – это поведение, требующее для своей реализации, по крайней мере, еще одного представителя своего вида. Сюда относят все варианты межсамцовых взаимодействий, репродуктивное (половое) и родительское поведение.
Социальные межсамцовые взаимодействия (парные или групповые) можно разделить на следующие категории:
социальный интерес – следование, принюхивание к партнеру, генитальный груминг;
защитное поведение – побежки (как активное избегание партнера), замирание (пассивная реакция затаивания, страха);
агрессивное поведение – угрозы, биение хвостом, нападения, толчки-отпихивания, погоня, агрессивный груминг, ходьба «шариком» и пр.;
сопровождающее взаимодействие несоциальное поведение – автогруминг, исследование клетки, рытье подстилки.
Как правило, встреча с новым партнером начинается с реакции социального интереса, далее перерастает в агрессивные взаимодействия, когда животные выясняют свой ранг, после чего интенсивность их социальных контактов снижается и носит во многом ритуализированный характер.
На инициацию, продолжительность и интенсивность социальных взаимодействий влияет уровень тревожности животных: чем он выше, тем меньше эти параметры. В целом тестовые ситуации можно варьировать, изменяя освещенность тестового поля (яркая – неяркая), территорию (знакомая – незнакомая), партнеров (знакомых – незнакомых).
Исследование полового поведения дифференцируют на изучение половой мотивации и непосредственного взаимодействия самца и самки. Анализ репродуктивного поведения применяется при тестировании трансгенных мышей, фармакологических исследованиях, изучении возрастной физиологии.
Уровень половой мотивации самцов оценивается по поведению «рвения» к рецептивной самке. На основе этого разработаны множество тестов: тесты с обучением и оперантным поведением, преодолением препятствий различной сложности, бeгом самца по движущейся в противоположном направлении беговой дорожке, тест «перегородка» и другие.
С точки зрения сексуального взаимодействия любая особь может быть оценена по критериям:
аттрактивности (привлекательности), оцениваемой в тестах по времени, проводимому около нее или ее запаха особью противоположного пола;
рецептивности (восприимчивости к сигналам сексуальной направленности), оцениваемой по соответствующему поведению в ответ на стимулы данного репертуара;
процептивности (характерному поведению тестерного животного, стимулирующему половую активность особей противоположного пола)
Все эти критерии могут быть использованы для создания тестов.
Тесты для исследования социального поведения животных чувствительны к анксиолитическим (противотревожным) и анксиогенным (тревогогенным) веществам, причем разные классы анксиолитиков эффективны в разных тестовых ситуациях.
Основной инструментарий – оборудование, регистрирующее моторное поведение: «Open field system», «Home cage system», «Ethostudio system» и др.
Наиболее распространенные тесты:
тесты, изучающие социальные взаимодействия на нейтральной арене;
тест «резидент-интрудер», где самцу, предварительно сидящему в изоляции и вследствие этого агрессивному, подсаживают партнера, после чего регистрируют весь спектр межсамцовых взаимодействий;
тест «перегородка», где самцы находятся по разные стороны перфорированной прозрачной перегородки, а социальный интерес (мотивация) измеряется по времени, проведенному у преграды.
Перечисленные методы используют для изучения генетики и молекулярных механизмов агрессии и тревожности, доминантно-субординантных отношений, социального стресса и др.
Созданы тесты для исследования процессов социального узнавания, привыкания и предпочтения.
Понятие «социальное узнавание» было введено в употребление в 1980-е гг. Оно основано на безусловном поведенческом ответе (интересе) животного при подсадке незнакомого партнера. Ольфакторное исследование подсаженной особи истощается со временем, тогда как подсадка нового партнера сопровождается возобновлением интереса со стороны тестерной особи. В первой сессии животных ссаживают для знакомства, потом рассаживают и вновь ссаживают вместе или с другим партнером. Узнавание определяется как значительное снижение времени ольфакторного исследования при повторном ссаживании со знакомым партнером, а забывание – как одинаковое исследование обоих.
В других вариантах протокола исследуют процессы социального привыкания и социального предпочтения. Например, сживаются вместе знакомый и новый партнер. В целом на поведение в тесте могут оказывать влияние различные характеристики стимулируемых животных (их социальный ранг, сексуальная аттрактивность, ольфакторные особенности). Развитие предпочтения в подобных экспериментах может отражать следствия предыдущих опытов (например, сексуальных контактов или контактов на фоне фармакологических вмешательств). Исследования социальной памяти – активно развивающаяся область поведенческой физиологии.
Есть тесты для исследования родительского поведения. Родительское поведение, характерно для многих видов млекопитающих. Это омплексная стратегия активности по заботе, вскармливанию и, в ряде случаев, обучению молодняка. Родительское поведение делят на активное и пассивное.
У лабораторных грызунов активное родительское поведение включает гнездостроительство, перенос детенышей из одного места в другое (как вариант – возврат в гнездо), вылизывание молодняка.
Пассивное поведение подразумевает принятие лактирующей самкой позы, подходящей для кормления детенышей.
Для оценки родительского поведения разработаны многочисленные тесты. Самые простые включают видеонаблюдение и регистрацию конкретных параметров родительского поведения в течение определенного интервала времени или его наблюдение после периода депривации (например, удаление детеныша или детенышей на срок до 3–4 часов).
Более усложненные варианты оценки родительского поведения могут включать предварительное обучение матери (оперантное поведение), или использование лабиринтов (Y-и Т-типов), Hole-board system.
Помещая в один из рукавов лабиринта или отверстие арены запаховую метку детеныша, оценивают аттрактивность (привлекательность) детского запаха для матери. Другой способ оценки эмоциональной значимости ребенка для матери исследуют в установке «Place preference system».
Тест на «местопредпочтения» – Place Preference System – широко используется для оценки разных видов поведения, как правило, с выраженной эмоциональной составляющей. Установка состоит из двух или трех камер. Автоматически регистрируются моменты перехода между частями, общее время нахождения в каждом отсеке, двигательная активность и пройденный путь. Вариант протокола для исследования родительского поведения: предварительное содержание в четные дни матери с детенышем в левом отсеке, в нечетные дни – одной матери в правом отсеке прибора. Далее оценивается предпочтительное место нахождения самки в отсутствие детеныша.
Рис.1. 35. Оборудование для теста на «местопредпочтения»
У видов, способных издавать звуки, изучают генетически обусловленные различия в параметрах осциллограмм (визуализированные звуковые колебания) «песен». Наиболее популярными среди исследователей являются видоспецифические брачные звуки.
Рис. 1.36. Фото малой чайки (Larus minutus) и осциллограмма ее брачной песни.
Рис. 1.37. Фото желтоголового королька (Regulus regulus) и осциллограмма его брачной песни.
В последнее десятилетие была разработана батарея стандартных тестов для поведенческого фенотипирования мутантных и нокаутных линий мышей – так называемый SHIRPA-протокол. Он включает более 40 пунктов (блоки 1 и 2 из табл. 1) и позволяет проводить универсальный скрининг с выявлением морфологических дефектов и нарушений в нервно-мышечной, сенсорной и вегетативной системах организма.
Последний, третий, блок тестов в Табл. 1, оценивает более тонкие функциональные особенности нервной системы, связанные с индивидуальным и социальным поведением животных, их интеллектом и психикой.
Преследуя единую цель всесторонней проверки функционирования нервной системы, разные лаборатории используют вариативные наборы поведенческих тестов.
Таблица 1. Вариант батареи тестов для фенотипирования животных
|
№ |
Блоки поведенческого и физиологического скрининга |
|
1. |
Общее здоровье, внешний вид, индивидуальные характеристики:
|
|
2. |
Оценка сенсорных и моторных функций животного:
|
|
3. |
Анализ высшей нервной деятельности животного:
|
Таким образом, генетики используют в своих исследованиях широкий арсенал методов, специфического оборудования и программного обеспечения для оценки поведенческого признака. Использование современных методологических и инструментальных возможностей поведенческого фенотипирования позволяет исследовать практически весь этологический репертуар животных.