Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Лекции Документ Microsoft Word.doc
Скачиваний:
107
Добавлен:
23.02.2015
Размер:
29.93 Mб
Скачать

Глава 5. Генетика поведения беспозвоночных животных.

5. 1. Генетика поведения круглых червей.

Основные закономерности биологии прокариот установлены в работах на E.coli, биологии эукариот - на дрожжах Saccharomyces cerevisiae, а среди многоклеточных животных самым изученным, пожалуй, является Caenorhabditis elegans(произносится как «ценорабдитис элеганс»). Это животное, которое легко культивировать, оно быстро развивается. Это маленькая (около 0,5 мм в длину) свободно живущая нематода.

Нематода (круглый червь) Caenorhabditis elegans — замечательный модельный объект для самых разнообразных исследований. В 2002 году Сиднею Бреннеру, который первым начал использовать этого червя в качестве модельного объекта в генетических и эмбриологических исследованиях, была присуждена Нобелевская премия.

Рис. 5.1. Сидней Бреннер

Одной из первых задач, которые поставил перед собой Сидней Бреннер и его сотрудники, было построение полной диаграммы строения нервной системы червя.

Тело каждой нормальной особи Caenorhabditis elegans содержит ровно 302 нейрона и 56 глиеподобных клеток. Все эти клетки, их морфология, расположение в пространстве, а также способы их соединений между собой и с мускульными клетками были полностью описаны много лет спустя после начала проекта. В 1986 году вышел объемный труд, обобщающий многолетние исследования, с подзаголовком, который дал ему Бреннер: «Сознание червя» («The Mind of a Worm»).

Ученые выяснили, что процесс развития Caenorhabditis elegans является очень строго упорядоченным. Это значит, что судьба каждой клетки эмбриона определена с самого начала, и можно с очень высокой степенью точности прогнозировать, какие клетки разовьются из данной клетки личинки. Каждая эмбриональная клетка-родоначальница дает начало своей линии клеток взрослого организма, формирующих определенную ткань.

Бреннер и его группа описали все существующие у Caenorhabditis elegans клеточные линии и проследили их судьбу под микроскопом. Решающую роль в этих исследованиях сыграл Джон Салстон.

Рис.5.2. Джон Салстон.

Теперь, если возникает необходимость определить значение какого-нибудь воздействия (или мутации) на развитие червя, это можно сделать очень корректно, так как благодаря работе группы Бреннера все развитие Caenorhabditis elegans на клеточном уровне описано до мельчайших деталей.

Рис.5.3. Caenorhabditis elegans

Сам Бреннер сфокусировал исследования на наборе генов червя, изменения в которых, как он продемонстрировал, влияли на работу мускулатуры и передвижение Caenorhabditis elegans. Он назвал их unc - генами, из-за того, что мутации в них приводили к некоординированным (uncoordinated) движениям. Впоследствии стало ясно, что unc-гены влияют не только на координацию движений, но также вовлечены в формирование и развитие нервной системы.

Бреннер, наряду с Салстоном, стал вдохновителем проекта по описанию генома Caenorhabditis elegans, полное картирование которого было завершено к концу 1998 года.

Генетический аппарат Caenorhabditis elegans достаточно простой: в 6 парах гомологичных хромосом содержится, около 3000 генов. Гаплоидный геном содержит 80 млн. пар нуклеотидов (в 17 раз больше, чем у E.coli и в 38 раз меньше, чем у человека).

С помощью мутационного анализа идентифицировано около 800 генов. Среди них гены, влияющие на форму и поведение червей, гены, кодирующие миозин и гены, контролирующие характер и направление развития, гены гибели и долголетия. Получена библиотека генома в виде большого набора перекрывающихся фрагментов ДНК.

Тело нематоды прозрачно, поэтому можно прижизненно наблюдать деление, миграцию и дифференцировку клеток, а также описывать генеалогические отношения и поведение всех клеток, начиная со стадии одноклеточного яйца и кончая взрослым животным.

Брен­нер индуцировал у Caenorhabditis elegans множество поведенческих мутаций и по­пытался выявить корреляцию поведенческих реакций со структурными и молекулярными особенностями этих мутантов.

Caenorhabditis elegansгермафродит, для которого характерно самооплодотворение, причем сначала продуцируется и запасается сперма, а затем развиваются и откладываются яйца, около 300 у каждой особи. Продолжительность жизненного цикла при температуре 20° С состав­ляет от 3 до 4 суток.

Самооплодотворение способствует возникновению гомозиготности, но у одной и той же особи могут возникать различные индуцированные мутации, поэтому в результате нерасхождения хромо­сом в мейозе постоянно появляется некоторое число самцов (0.1%), ко­торые при скрещивании с гермафродитами переносят ту или иную му­тацию, которую и используют в качестве генетической метки.

Caenorhabditis elegans весьма удобен для изучения генетики поведения, поскольку его легко разводить в лабораторных условиях, он имеет гаплоидный набор из шести хромосом, соответствующих шести группам сцепления.

У Caenorhabditis elegans довольно высок процент клеток, подверженных апоптозу в ходе нормального развития: одна из каждых шести клеток генетически запрограммирована к гибели. Эта гибель полоспецифична, так что гибель одной клетки у эмбрионов одного пола не оз­начает, что погибнут гомологичные клетки у эмбрионов другого пола.

Симметрия у Caenorhabditis elegans также формируется своеобразно, порой не в результате симметричного деления клеток, а благодаря их активным перемещениям.

Как и у других организмов, важную роль в развитии нематод игра­ют гомеозисные гены. У Caenorhabditis elegans, например, у мутантов по локусу Пп-12 нарушено развитие вульвы, эти мутанты стерильны. Вероятно, как и у дрозофилы, функционирование гомеозисных генов регулирует про­цесс регионализации нервной системы нематод.

Caenorhabditis elegans имеет цилиндрическое, волосовидное, несегментированное тело, оставляющее на агаре в чашке Петри легко различимый след, который можно регистрировать и анализировать. Эти видимые бороздки в агаре могут проходить вдоль градиента аттрактантов, вроде химических соединений (циклические нуклеотиды), катионы, щелочные значения рН.

Характер расположения бо­роздок отражает особенности поведения:

  • ориентацию — движение вдоль градиента концентрации, включая «боковое» движение головы червя;

  • скопление — постоянное скопление большого числа нематод в какой-либо особой точке градиента;

  • привыкание — наблюдаемое по­сле того, как контейнер и его содержимое делаются привычными для особи.

Анализ различных мутантов, характеризующихся дефектами кутикулы, позволил прийти к выводу, что ориентирование в химическом градиенте обусловливается сенсорными органами, расположенными на голове животного. Мутантные черви со вздутиями в дистальной части хвоста ориентируются нормально, в то время как наличие таких взду­тий на голове делает ориентацию невозможной.

Еще в начале работы с Caenorhabditis elegans была описана мутация age-1, при которой продолжительность жизни увеличивается до 34 дней.

Другая группа мутаций, влияющих на продолжительность жизни, связана с особенностями жизненного цикла этой нематоды. По окончании эмбриогенеза из яйца выходит личинка первой стадии (L1), которая затем проходит фазы L2, L3 и L4, после чего особь становится половозрелой.

Однако в жизненный цикл Caenorhabditis elegans может включаться еще одна, специфическая стадия - стадия покоящейся личинки, называемой «дауером» (dauer) — стадия d. В таком состоянии животное успешно переживает неблагоприятные условия среды, например перенаселение или недостаток пищи.

Стадия d может наступить в период после стадии L2 вместо L3. При восстановлении пригодных для жизни внешних условий и стадии d червь переходит в стадию L4.

Ученые предполагают, что в стадии d у животного происходит своеобразное выключение процессов старения, поскольку подобные покоящиеся личинки могут оставаться жизнеспособными на срок до 1 года.

Рис.5.4. Жизненный цикл Caenorhabditis elegans

Выявлено семейство генов daf, участвующих в формировании стадии покоящейся личинки. Манипулируя условиями выращивания личинок с мутацией гена daf-2, можно получить особей, которые почти столь же жизнеспособны, как и особи дикого типа, но длительность их жизни значительно увеличена — до 43 дней.

Личиночное развитие Caenorhabditis elegans контролируется активностью четырех классов хемосенсорных нейронов. При этом выбор между нормальным развитием и развитием в упомянутую личиночнуюформу – «dauer larva» –регулируется конкурирующими средовыми стимулами: пища и «dauer pheromon» (специфический феромон).

Гибель нейронов классов ADF, ASG, ASI и ASJ приводит к тому, что животные развиваются как «dauer»-личинки независимо от средовых условий. Анализ мутантов, дефектных по «dauer formation» показывает, что хемосенсорные нейроны активны в отсутствие сенсорных входов и что «dauer» феромон тормозит способность этих нейронов генерировать сигналы, необходимые для нормального развития.

Было показано, что у нематод имеется два различных состояния — активное и относительно неподвижное. С помощью видеокамеры исследователи фиксировали положение червя каждые 10 секунд и затем, сравнивая картинки, оценивали активность движения червя на бактериальной питательной среде. В результате такого видеонаблюдения выяснилось, что перед каждой линькой (а линяет он 4 раза) червь двигается значительно реже и меньше и сохраняет неподвижность сравнительно дольше.

Между линьками проходило примерно 10-11 часов, из которых период малой активности занимал около 2 часов. Этот период относительного покоя был назван летаргическим.

Летаргический период сам по себе не однороден: несколько раз за это время червь совершает быстрые движения, то есть на фоне покоя фиксируются 10–15-секундные всплески активности.

Конечно, обнаруженное у нематод летаргическое состояние настоящим сном никто не считает, хотя некоторые черты этого состояния повторяют свойства сна у высших животных: во-первых, это замедленная реакция на раздражители по сравнению с активным состоянием; во-вторых, если некоторое время не давать червю «спать», то затем реакция на раздражители еще сильнее ослабляется, то есть летаргия становится более глубокой.

Реакцию на раздражители исследователи проверяли по скорости и разнообразию двигательных ответов на химический стимул и на механический толчок — в обоих случаях было отмечено явное замедление реакции и снижение разнообразия реакций у животных в летаргическом состоянии. Депривация (лишение сна) достигалась путем механического раздражения червя. В результате нематода вынуждена была постоянно двигаться. Когда депривацию прекращали, червь немедленно переходил к летаргическому состоянию, и можно было проверять реакцию на стимулы.

И действительно, после 20–30-минутной депривации реакции на стимулы замедлялись, то есть «сон» становился более глубоким.

Таким образом, Caenorhabditis elegans переживает состояния покоя, во время которых чувствительность нейронов остается на прежнем уровне, так как специфические реакции на раздражители всё же фиксируются. Но зато в это время снижена скорость и эффективность обработки сигналов, идущих от чувствительных нейронов к мускулатуре. В результате замедляются и становятся менее разнообразными движения червя.

Одной из самых распространенных поведенческих моделей, используемых для анализа генетики поведения Caenorhabditis elegans, является пищевое поведение.

Глотка этой нематоды является «пищевым насосом», состоящим из трех частей:

  • тела (corpus), которое поглощает бактерий;

  • перемычки (isthmus), которая проводит бактерий к терминальной луковице

  • терминальной луковицы (terminal bulb) в которой бактерии размалываются и проводятся в кишку.

Глотка окружена базальной мембраной и содержит 80 клеток, 20 из которых — нейроны фарингеальной нервной системы (гомолог интрамуральной нервной системы пищеварительной трубки позвоночных). Эта система связана с остальной нервной системой парой нервов.

Наличие автономной иннервации позволяет глотке нормально функционировать в случае её изоляции in vitro. Только один из 20 нейронов (М4) существен для жизни. Он иннервирует задний отдел перемычки, и в случае его отсутствия она остается закрытой, бактерии не транспортируются для размалывания и переваривания, так что животное голодает.

Черви с интактным М4 нейроном и отсутствующими 19 другими жизнеспособны, хотя эти нейроны необходимы для нормального паттерна.

Леон Эйвери изолировал и охарактеризовал гены, которые контролируют присутствие или отсутствие, паттерн иннервации и функции 20 нейронов, ответственных за пищевое поведение. Было об­наружено 35 генов, локализованных во всех 6 хромосомах, и предпола­гается, что имеется еще столько же, отвечающих за данную форму по­ведения. Выявленные этим ученым 52 мутации по своему фенотипическому эффекту можно разделить на три группы:

  • Мутанты eat действу­ют на подвижность фарингеальных мышц и, кроме того, на функциони­рование мышц стенки тела. Многие мутанты этого типа вызывают на­рушение функций некоторых нейронов.

  • Мутанты pha вызывают дефекты фаринкса, которые предотвраща­ют нормальное пищевое поведение и часто вызывают дефекты в мор­фогенезе и клеточной спецификации.

  • Мутанты phm обусловливают слабые или нерегулярные сокращения фарингеальных мышц. Они могут также на­рушать нейральный контроль мышечной функции.

У Caenorhabditis обнаружены также система генов, контролирующих развитие хеморецепторов, которые реагируют на водораствори­мые аттрактанты (биотин, лизин, сАМР, ионы натрия и хлора), летучие репелленты (октанол), летучие аттрактанты (диацетил, пиразин, иниазол, бензальдегид, изоамиловый спирт, тиазол), а также система генов, контролирующих развитие температурных рецепторов.

Было идентифицировано более 40 генов, кодирующих трансмембранные рецепторы. Эти «рецептороподобные» гены можно подразделить на 6 семейств (sra. srb, srg, srd, sre, srd), основываясь на сходстве последовательностей их ДНК.

Гены одного и того же семейства часто собраны в один кластер. Некоторые из этих кластеров могут коэкспрессироваться наподобие оперонной системы, однако, в некоторых случаях ге­ны из одного кластера экспрессируются в разных нейронах. Предпола­гается, что в целом геноме Caenorhabditis elegans содержится более 100 генов, экспрессирующихся в хеморецепторах.

В последнее время идентифицированы гены, контролирующие нейрогенез у Caenorhabditis elegans: mec-3, определяющий наподобие гена cut у Drosophila специфичность типа нервной клетки и гены ипс-5, ипс-6, ипс-40, наподобие гена fas-l у Drosophila, контролирующие характер роста нервных отростков.

У Caenorhabditis elegans были получены разные поведенческие мутанты. Примерно у половины мутантов с нарушенным поведением были найдены отклонения в строении нервной системы. Их можно раз делить на 4 группы.

1. Изменения в клетках-предшественницах нейронов. Поскольку ход нормального развития нейронов из нейробластов изучен у этого вида достаточно хорошо, мутации в этих элементах легко обнаружить. Они могут проявляться в виде особенностей поведения на разных стадиях развития организма.

2. Изменения в специфичности синаптических связей. Поскольку соединения нейронов взрослой особи дикого типа уже известны возникающие вследствие мутаций структурные изменения синаптических соединений можно с достаточной надежностью сопоставить аномалиями поведения у таких животных.

3. Изменения в расположении отростков нейронов. Создана полная топографическая карта нервной системы Caenorhabditis elegans позволяющая выделить таких мутантов, у которых отростки нейронов идут к аномальным мишеням. Такие мутации изменяют направление прорастания и характер контактов у нейронов сразу нескольких классов. Очевидно, что изменения поведения при этом достаточно разнообразны.

4. Изменения в функции нейромедиаторов. Эту категорию эффектов оказалось возможным проанализировать с развитием методов иммуноцитохимии и биохимии. Данные о медиаторной специфичности конкретных нейронов, как правило, оказываются неточными.

Примером мутаций, нарушающих движения, может служить мутация roller, при которой червь перемещается, переворачиваясь через головной и хвостовой концы, и bent head: при этой мутации изменена анатомия головного конца, и вместо обычных «рыскающих» движений перемещение идет по спирали. Движения червя обеспечиваются элементами брюшной нервной цепочки. Ее нейроны и их соединения хорошо описаны, известны также и эмбриональные клетки-предшественницы этих нейронов. Выделяют пять классов нейронов, которые подразделяются на два главных типа: возбудительные нейроны, инициирующие движение животного вперед или назад, и тормозные нейроны, координирующие сокращения мышц двух сторон тела.

Одними из первых, описанными у Caenorhabditis elegans, были мутации группы Unc (uncoordinated).

Фенотипически группа мутаций Unc подразделяется на 3 категории:

  • животные либо сохраняют неподвижность в покое, либо при стимуляции, которая в норме побуждает их двигаться вперед или назад, сокращаются все мышцы одновременно;

  • животные не способны двигаться в одном из направлений (вперед или назад), а при соответствующей стимуляции закручиваются либо дорсальной, либо вентральной стороной кверху;

  • животные неспособны двигаться по прямой, не извиваясь

Несмотря на относительную простоту, поведение Caenorhabditis elegans может видоизменяться в результате накопления индивидуального опыта. Экспериментально показано, что у этих животных могут происходить процессы: неассоциативного обучения — привыкание к регулярно действующему стимулу (механическое сотрясение), растормаживание привыкания и сенситизация.

Микроскопическая нематода как объект генетики поведения дает возможность исследовать нейроморфологические основы примитивных поведенческих реакций.

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Оставленные комментарии видны всем.