диссертации / 98

81

Подробная схема приёма ЛС во 2-й группе пациентов представлена в табл.

6.

82

Таблица 6

Схема приёма ЛС у больных ГА с потерей 50% и более волос на скальпе, а также частичной или полной утратой волос на других участках кожного покрова

83

Оценка клинической эффективности лечения

Контроль эффективности лечения осуществлялся визуально невооружённым глазом, а также с помощью видеотрихоскопического оборудования во время повторных амбулаторных приёмов. На заключительном этапе определяли эффективность лечения с использованием следующих критериев:

•нет эффекта: наблюдается дальнейшее развитие заболевания в виде расширения границ очагов либо изменения отсутствуют, в эту группу включали также пациентов с ростом одиночных велюсных волос;

•частичный эффект: некоторая степень возобновления роста пигментированных волос в очагах, которые не маскируют облысение;

•полный эффект: косметически приемлемое (до 95%) или полное возобновление роста волос в очагах.

Ближайшие и отдалённые результаты изучали спустя 3 и 6 мес после завершения лечения.

Методы исследования. Были исследованы биоптаты кожи скальпа 44 больных ГА: 32 женщин и 12 мужчин в возрасте от 18 до 56 лет (средний возраст 31,5 года). У 20 пациентов наблюдалась активная стадия заболевания, у 24 – хроническая. Локальная форма (ЛА) ГА была констатирована у 28 пациентов, тотальная (ТА) и универсальная (УА) – у 16. Сведения о длительности последнего обострения до момента исследования у пациентов представлены в табл. 7.

84

Таблица 7

Клиническая характеристика больных ГА и продолжительность последнего эпизода

До начала лечения биоптаты у больных ГА брали в очаге облысения на коже скальпа с помощью одноразового циркулярного ножа диаметром 4 мм (punch-биоптат) под местной анестезией раствором ультракаина (1 мл). Дефект кожи ушивал хирургическими шёлковыми нитями, швы снимали через 3 дня.

Вдинамике образцы кожи скальпа были изучены у 13 пациентов (10 женщин и 3 мужчин). У 6 больных до начала лечения по клиническим данным наблюдалась активная стадия и у 7 – хроническая, в том числе у 5 – ТА и УА. Образцы ткани в процессе медикаментозной терапии (через 9–10 нед с момента возобновления роста волос) брали в зонах, максимально приближенных к месту первичного их изътия (до лечения).

Вкачестве контроля изучены биоптаты кожи скальпа 7 здоровых людей (1 мужчины и 6 женщин; средний возраст – 41,6 года), полученные в ходе пластических операций.

Биопсийный материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, содержащем фосфатный буфер, обрабатывали в аппарате гистологической проводки тканей «Scandon» (Великобритания) и заливали в парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки материала не превышало 48 ч. Затем готовили серийные парафиновые срезы толщиной 4 мкм, фиксировали их на предметных стеклах и инкубировали в термостате при температуре 370С в течение 12 ч. Затем срезы депарафинировали, обезвоживали и подвергали регидратации в

85

батарее, включающей 3 смены ксилола, 2 смены абсолютного этилового спирта, спирты убывающей крепости (95; 80 и 70%) и дистиллированную воду.

Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. При проведении патоморфологических исследований оценивали общие морфологические процессы при ГА – такие, как наличие и интенсивность воспалительного инфильтрата, его распределение относительно структур кожи, наличие склероза, патологических изменений в эпителии фолликулов, присутствие волосяных стержней в фолликуле.

Иммуногистохимический (ИГХ) метод использовали для верификации диагноза ГА. Для иммунофенотипирования количества и распределения

CD25/IL2Rα+-клеток, CD95+-клеток (или Fas), CD95(L)+ (или FasL), bcl-2+, Ki67+, CK15+, VEGF+ использовали соответствующие моноклональные антитела (табл. 8).

Серийные парафиновые срезы образцов исследовали ИГХ-методом. Для этого часть парафиновых срезов монтировали на стекла с поли-L-лизиновым покрытием. Демаскировка антигенных детерминант осуществлялась кипячением

вцитратном буфере с рН 6,0 в СВЧ-печи при мощности 600 Вт в течение 20 мин. Далее стекла остывали в растворе цитратного буфера 20 минут при комнатной температуре. Во избежание высыхания срезов последующие этапы ИГХ-реакции проводили во влажной камере. Остывшие стекла инкубировали в течение 15 мин с 3% раствором Н2О2. После обработки перекисью водорода стекла ополаскивали

врастворе фосфатного буфера (рН 7,0–7,6), после чего срезы инкубировали с 1% раствором альбумина в течение 30 мин. По окончании инкубации излишки альбумина аккуратно стряхивали со срезов и наносили первичные антитела (табл. 8).

86

Таблица 8

Перечень моноклональных антител и их специфичность

Срезы инкубировали с первичными антителами от 30 мин до 1 ч (в зависимости от рекомендаций фирмы-производителя в спецификации к антителу). Далее срезы отмывали в фосфатном буфере (рН 7,0–7,6) для удаления излишков первичных антител, не связавшихся с эпитопами, и инкубировали с вторичными антителами в течение 1 ч, затем ополаскивали в фосфатном буфере (рН 7,0–7,6). В качестве вторичных антител использовали авидин-биотиновый комплекс (АВК KIT, DAKO, Дания). Для визуализации места связывания антитела с антигеном использовали фермент (пероксидазу хрена) в присутствии субстрата (перекиси водорода) и хромогена с 3,3-диаминобензидином (LSAB, DakoCytomation, Denmark).

В результате образовывался нерастворимый в органических растворителях конечный продукт реакции, который визуализировался в виде коричневого окрашивания структур клеток. Далее срезы ополаскивали в дистиллированной воде и подкрашивали ядра гематоксилином. Затем срезы обезвоживали в спирте

87

нарастающей крепости (70; 80 и 95%) и в 2 сменах абсолютного спирта, дифференцировали в 3 сменах ксилола, после чего срезы заключали под покровное стекло, используя синтетическую монтирующую среду.

Результаты оценивали полуколичественным и количественным методами. Оценка выраженности воспалительного инфильтрата, склероза и повреждения эпителия ВФ проводилась на гистологических срезах, окрашенных гематоскилином и эозином. Каждый из названных признаков оценивали по 6- балльной системе: слабая выраженность – 2 балла, умеренная – 4, выраженное изменение – 6 баллов. Содержание CD25/IL2Rα, CD95, FasL, VEGF, Ki67, CK15+, bcl-2 определяли по ИГХ-данным: процент окрашенных клеток на 100 клеток данного типа (эпителия).

Детекцию клеток, находящихся в состоянии апоптоза, определяли с использованием in situ labeling TUNEL System (Promega, USA). Данный метод основан на выявлении разрывов ДНК в ядрах клеток с помощью ферментативных реакций. Подсчет процента апоптозных телец проводили количественным методом из расчета на 300 клеток.

88

Глава 3. Результаты собственных исследований

3.1. Оценка степени тяжести заболевания и общая характеристика данных с учётом тяжести процесса

С целью точного определения степени тяжести патологического процесса с учётом площади потери волос на голове были использованны критерии SBN. Признак S был условно ранжирован на 5 градаций: от 1 до 5 баллов, соответствовавших определённому проценту потери волос на голове (см. выше

«Оценка степени тяжести заболевания»). Показатель потери волос на туловище B имел 3 градации, соответствовавшие степени вовлечённости в патологический процесс: 0 – волосы на туловище не вовлечены, 1 балл – вовлечены частично, 2 балла – полностью отсутствуют. Показатель дистрофических изменений ногтей N имел 2 градации: 0 – ногти здоровы, 1 балл – есть дистрофические изменения.

Мы использовали оценку степени тяжести ГА по сумме баллов S+B+N, где признак S был ведущим. Согласно этой оценке, лёгкой форме соответствовала сумма показателей S+B+N=1, если сумма определялась в диапазоне 2–3, то это соответствовало среднетяжёлой форме, в диапазоне 4–8 – тяжёлой форме.

Анализ данных показал, что клинические варианты гнёздной алопеции с потерей >25% волос на голове статистически значимо осложнялись признаками частичной (у 28%; p≤0,000007) или полной (у 13,4%; р<0,01) утраты волос на туловище и конечностях, а также дистрофией ногтевых пластинок (у 24,4%; р≤0,000004), что утяжеляет патологический процесс. При потере >75% волос на голове потеря волос на туловище и конечностях встречалась у 82% пациентов

(частичная – у 36,4%; р≤0,01; полная – у 45,5%; p≤0,00000004), дистрофия ногтей

– у 46% (р≤0,00006).

89

Таким образом, анализ данных, учитывающий признаки SBN, позволяет точнее оценить степень тяжести ГА, а сумма показателей в баллах может быть применена для оценки тяжести заболевания. Болезнь оценивается как лёгкая при сумме баллов не более 1, среднетяжёлая – при сумме баллов 2–3, тяжёлая – при сумме баллов 4–8. Положительные значения признаков B и N рассматриваются, как признак утяжеления патологического процесса, модель S2–S3 – как среднетяжёлая и модель S1 (потеря до 25% волос) – как лёгкая форма заболевания.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что полиморфизм клинических вариантов необходимо учитывать при выборе тактики лечения. Системные методы лечения могут быть применены уже при потере волос на голове >25% в случае поражения волос на других участках кожного покрова и дистрофии ногтей.

Для облегчения сбора информации, касающейся особенностей анамнеза, пациенты были условно разделены на 2 группы: с лёгким течением и потерей волос <25% площади скальпа и со среднетяжёлым и тяжёлым течением ГА, с потерей волос на голове >25%.

Анализ данных с учётом тяжести течения заболевания показал, что у пациентов с более тяжёлой формой ГА заболевание чаще (p=0,03) проявлялось в возрасте до 13 лет (табл. 9). При этом у них чаще отмечалось >3 эпизодов (у 41 из 82 больных; для сравнения: при лёгком течении – у 14 из 63 пациентов; р=0,001).

90

Таблица 9

Выраженность потери волос с учётом возраста пациентов при начале

Продолжительность последнего эпизода >2 лет также чаще наблюдалась при более тяжёлом течении (р≤0,04). Статистически значимых различий по отягощённости семейного анамнеза в рассматриваемых группах не выявлено, ГА в анамнезе у ближайших родственников по данным анамнеза встречалась соответственно в 6,5% и 11% случаев (р=0,4) и в среднем составила 9%.

3.1.1. Результаты клинического обследования пациентов, особенности дерматоскопической картины с учётом активности заболевания

Активная стадия заболевания была выявлена у 77 пациентов – наблюдалось расширение границ очага облысения в виде зоны расшатанных волос по периферии очага, где волосы при небольшом усилии легко обламывались. В процессе клнико-лабораторного мониторинга у этих пациентов появлялись новые очаги алопеции или имеющиеся очаги сливались между собой. Пациенты испытывали субъективные ощущения в виде зуда, чувства ползания мурашек в