диссертации / 98

11

практически не используются. Определённые трудности при обследовании и наблюдении пациентов с ГА возникают из-за отсутствия общего стандарта при оценке потери волос. Следствием этого являются некоторая произвольность и абстрактность при сборе анамнеза и в оценке облысения у пациентов с ГА большинством отечественных исследователей и практикующих дерматологов. Между тем существует международное руководство по исследовательской оценке пациентов с ГА, включающее основные параметры, обязательные для выявления и последующего анализа [179]. Разработка на основе этого руководства тематической карты пациента с ГА отсеет сбор неактуальной информации, а также позволит осуществлять амбулаторной мониторинг и лечение больных ГА в соответствии с мировыми стандартами.

Целью исследования была разработка лечениея ГА с учётом клинического полиморфизма и патогенетических особенностей заболевания.

Задачи исследования

1.Применить шкалу оценки SBN для уточнения варианта клинического полиморфизма ГА у пациента и определения степени тяжести заболевания.

2.Изучить иммуногистохимические особенности местных иммунных реакций в коже при ГА на основе распределения CD25/IL2Rα+-клеток в динамике лечения.

3.В сопоставлении с контролем (здоровые) изучить состояние тканевого гомеостаза при ГА с учётом особенностей клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза на основе распределения ключевых молекул Ki67, CK15, bcl-2, CD95, FasL и детекции апоптозных клеток с использованием in situ labeling TUNEL System.

4.Изучить в динамике иммуногистохимические особенности ангиогенеза в очагах с ГА на основе распределения VEGF+-клеток.

12

5.На основе результатов клинических, патоморфологических и иммуногистохимических исследований кожи разработать метод лечения клобетазола пропионатом в форме мази 0,05% в виде монотерапии и в комбинации с миноксидилом и применить его при ограниченных формах ГА с потерей до 50% волос. Сравнить клиническую эффективность предложенных методов лечения с клиническим эффектом внутриочаговых инъекций бетаметазона дипропионата/бетаметазона натрия фосфата при аналогичных формах ГА.

6.Разработать и применить метод комплексного лечения тяжёлых форм ГА преднизолоном и циклоспорином А в низких терапевтических дозах. Сравнить клиническую эффективность лечения ГА с традиционной монотерапией ГКС.

Научная новизна исследования

Впервые для наблюдения пациентов с ГА применён протокол амбулаторной карты, разработанный с учётом международных рекомендаций по исследованию пациентов с ГА.

Изучено состояние клеточного гомеостаза ВФ кожи скальпа здоровых людей путём изучения баланса между дифференцировкой, пролиферацией и апоптозом кератиноцитов ВФ, а также особенности распределения регуляторных молекул меж- и внутриклеточных взаимодействий при иммуногистохимическом (ИГХ) исследовании. Установлено, что состояние тканевого гомеостаза в здоровом анагеновом ВФ поддерживается за счёт баланса между процессами пролиферации и дифференцировки, который формируется в условия контроля программируемой клеточной гибели с участием противоапоптозного белка bcl-2, выявляемого в клетках матричной зоны ВФ. В иммунной толерантности неизменённого ВФ участвуют CD25/IL2Rα+-клетки.

Упациентов с ГА изучены особенности нарушения клеточного гомеостаза

ваффектных тканях, которые проявляются выраженным апоптозом,

13

прекращением дифференцировки, резким снижением пролиферативной активности клеток ВФ.

Установленно, что ключевым механизмом дисморфогенеза ВФ при ГА является взаимодействие Fas-FasL между клетками ВФ и перибульбарного инфильтрата, происходящее в условиях отсутствия тканевых регуляторных CD25/IL2Rα+-клеток; отсутствие этих клеток в образцах ткани после лечения объясняет возможный механизм развития рецидива болезни.

Установлено, что особенности клинической картины заболевания, свидетельствующие об активности патологического процесса, коррелируют с патоморфологическими изменениями в тканях при ГА и отражают особенности патофизиологического развития заболевания.

Выявлен двойственный характер изменений пролиферативной активности и дифференцировки кератиноцитов ВФ. В активной стадии заболевания пролиферативная активность клеток минимальна, тогда как в хроническую стадию появляются признаки её активации.

Установлены генные механизмы сохранения пула клеток, участвующих в регенерации волос при ГА, о чём свидетельствует появление антиапоптозных bcl- 2+-клеток в зоне клеток матрикса ВФ в хроническую стадию болезни.

Разработаны патогенетические методы лечения ГА на основе полиморфизма клинических вариантов заболевания, в частности площади потери волос на голове и вовлечённости в патологический процесс волос туловища и конечностей; дана оценка эффективности предложенных методов лечения. Целесообразность и этапность применения лекарственных средств рекомендуется с учётом иммуноморфологических особенностей заболевания, которые меняются в соответствии с его активностью. Обоснована эффективность применения ГКС и нецелесообразность применения в активную стадию ГА вазоактивных препаратов.

14

Теоретическая и практическая значимость работы

В результате проведённых исследований изучены нарушения тканевого гомеостаза и местных иммунных реакций в коже при ГА, которые позволяют уточнить патогенез заболевания и способствуют дальнейшему пониманию природы болезни; выявлены целевые мишени терапевтического воздействия на патологический процесс, разработана система оценки тяжести болезни и оптимальный подход к лечению. Дерматоскопические критерии оценки ГА, коррелирующие с патоморфологической картиной заболевания, облегчают оценку активности патологического процесса и помогают выбрать оптимальный метод лечения. Впервые разработан дифференцированный алгоритм лечебных мероприятий, учитывающий активность заболевания и площадь потери волос на голове и туловище. Метод местной иммуносупрессивной терапии показал высокую эффективность и безопасность при лечении пациентов с потерей до 50% волос на голове; метод системного применения комбинации иммуносупрессивных препаратов при потере волос на голове свыше 50% показал высокую клиническую эффективность и нормализующее воздействие на состояние тканевого гомеостаза и местные иммунные реакции в очагах облысения у больных ГА, снизил развитие побочных эффектов и удлинил ремиссию.

Методология и методы исследования.

Методология настоящего исследования спланирована с учетом современных принципов научного познания и организована адекватно поставленной цели. В работе использован современный комплекс клинических, лабораторных, инструментальных, патоморфологических и иммуногистохимических (ИГХ) методов исследования. Нозологическая модель участников исследования соответствовала диагнозу «гнёздная алопеция» (шифр

15

L63 в соответствии с МКБ-10) и различным клиническим формам ГА: локальной, офиазису, неуточнённой (incognita), тотальной и универсальной алопециям (коды диагнозов: L63.8, L63.2, L63.8, L63.9, L63.0 и L63.1).

В соответствии с единым планом обследования пациентам проводили следующие процедуры: клинический осмотр, сбор анамнестических данных, запись в амбулаторной карте и заполнение тематической истории болезни пациента с ГА. Комплекс клинических исследований включал определение степени тяжести ГА. Клинико-лабораторная диагностика включала рутинные лабораторные анализы (общий анализ крови, общий анализ мочи); развернутый биохимический анализ крови с определением уровня аспартат- и аланинаминотрансферазы, глюкозы, белка, общего холестерина, общего билирубина, креатинина, кальция, кортизола. При необходимости у больных исследовали содержание гормонов щитовидной железы, проводили флюорографическое исследование, консультации смежных специалистов (гинеколога, эндокринолога, офтальмолога).

Инструментальные методы исследования включали дерматоскопию очагов поражения. Для оценки состояния волосяных фолликулов и проведения патоморфологических исследований брали биопсию в очагах поражения, оценивали общие морфологические процессы при ГА при окраске препаратов гематоксилином и эозином. Иммуногистохимический (ИГХ) метод применили для изучения тканевого гомеостаза и местных иммунных реакций, используя соответствующие моноклональные антитела: к рецептору IL2 - CD25/IL2Rα+, к мембранному белку, опосредующему апоптоз CD95+ (или Fas), лиганд для молекулы Fas - CD95(L)+ или FasL (все – LabVision, разведение 1:100), к

внутриклеточному белку, подавляющему апоптоз bcl-2+ (Dakocytomation, разведение 1:100), к универсальному маркёру пролиферации Ki67+, к белку внутриклеточных филаментов клеток базального слоя многослойного эпителия CK15+(все Dako, разведение 1:100), к фактору роста сосудистого эндотелия

16

VEGF+ (Epitomiks, разведение 1:100). Детекцию клеток, находящихся в состоянии апоптоза, определяли с использованием in situ labeling TUNEL System (Promega, USA).

Статистический анализ проводили с применением пакета прикладных программ STATISTICA 6.0. Проверка на нормальность распределения осуществлялась с помощью критерия Шапиро–Уилка. Описательная статистика количественных признаков представлена в виде среднего значения и ошибки среднего (M±m). При сравнении показателей до и после лечения внутри групп (анализ признаков в динамике) использовали тест Вилкоксона. При сравнении групп по количественным признакам использовали U-тест Манна–Уитни. Оценка корреляционных связей осуществлялась с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Для сравнения достоверности различий при оценке частот распределения побочных эффектов в подгруппах был использован точный критерий Фишера.

Положения, выносимые на защиту:

1.Клинические особенности течения ГА включают полиморфизм клинических вариантов, которые характеризуются потерей волос разной степени выраженности на участках кожного покрова с ростом волос. Увеличение площади потери волос на голове сопровождается более частыми признаками потери волос на туловище и конечностях, а также дистрофическими изменениями ногтевых пластинок, что утяжеляет заболевание и требует адекватной терапии.

2.Тканевой гомеостаз в здоровом ВФ поддерживается за счёт сбалансированных процессов апоптоза, пролиферации и дифференцировки клеток, которые имеют иммунную регуляцию и осуществляются при участии небольшого количества CD25/IL2α+-клеток.

17

3.В процессе развития ГA важную роль играют Fas/FasL-пути апоптоза клеток ВФ, формирующиеся в условиях нарушения клеточной иммунной регуляции в отсутствие антиапоптозного белка bcl-2 в клетках ВФ и регуляторных CD25/IL2Rα+-Т-клеток дермы.

4.Существует взаимосвязь между патофизиологическими особенностями течения заболевания и динамикой репаративных процессов в тканях с ГА. Тенденция к восстановлению гомеостаза проявляется снижением воспалительных процессов, сопровождающихся появлением противоапоптозных bcl-2+-клеток в матричной зоне ВФ, а также клеток в стадии дифференцировки и пролиферации в эпителиальной выстилке ВФ.

5.Ведущая роль активированных цитотоксических лимфоцитов при развитии ГА обусловливает преимущественное применение в лечении ГКС. При выборе способа лечения необходимо учитывать активность патологического процесса, площадь потери волос на голове, вовлечённость

впатологический процесс волос на других участках кожного покрова. Усиление процессов ангиогенеза в активную стадию заболевания требует осторожности при назначении вазоактивных препаратов, которые способны поддержать или усугубить в этих условиях патологический процесс.

6.При потере до 50% волос на голове эффективно местное лечение ГКС. Максимальная эффективность лечения с помощью внутрикожных инъекций

вочаг ГКС бетаметазона дипропионата/бетаметазона натрия фосфата

наблюдается при площади потери волос до 10см2 и снижается по мере её

внутрикожных инъекций ГКС, но не зависит от площади потери волос на голове.

7. При потере >50% волос на голове клиническая эффективность комбинированной терапии низкими лечебными дозами преднизолона и ЦсА

18

сопоставима с таковой традиционного лечения средними дозами преднизолона, но позволяет снизить развитие побочных эффектов и удлинить ремиссию в ближайшие сроки наблюдения.

Степень достоверности полученных результатов

Результаты исследования достоверны, что определяется достаточным объёмом исследования и применением современных методов статистической обработки и анализа.

Апробация работы

Диссертация апробирована 21 июня 2013г. на совместной научнопрактической конференции коллективов кафедры кожных болезней и косметологии ФУВ ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздрава России, кафедры кожных и венерических болезней Первого Московского Государственного медицинского университета имени И.М.Сеченова, кафедры патологической анатомии Первого Московского Государственного медицинского университета имени И.М.Сеченова, и сотрудников консультативнополиклинического отделения ГБУЗ «Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии ДЗ г.Москвы», протокол № 28/13.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 24 работы, в том числе 10 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, а также монография «Клиническая трихология».

Материалы диссертации докладывались на форумах Национального альянса дерматологов (2008), на 2-м конгрессе EAAD в Москве (2012), Международном трихологическом симпозиуме (2012) в Лиссабоне (Португалия), на 16-м

19

Международном конгрессе EHRS (2012) в Барселоне (Испания), Международном форуме дерматовенерологов и косметологов (2013) в Москве; на форумах «Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики» (2011, 2012), постерные сообщения на 7-м Всемирном конгрессе по исследованию волос (2013) в Эдинбурге (Шотландия) и др.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 226 страницах и включает 40 рисунков (в том числе фотографии больных, блоки микрофотографий, схемы и графики), 23 таблицы, приложение; список библиографии насчитывает 275 источников, из них 22 – работы отечественных авторов.

20

Глава 1. Обзор литературы

ГА представляет собой воспалительное заболевание ВФ, медиированное цитотоксическими Т-лимфоцитамив в условиях нарушения иммунной толерантности анагеновыми фолликулами. Несмотря на то, что заболевание известно со времён Гиппократа, его причина до сих пор продолжает оставаться загадкой. Этиология и патогенез ГА долгое время пытались изучить с помощью исследования различных параметров периферической крови. Между тем современные знания в области биологии и морфологии волоса заставляют поновому взглянуть на ВФ и признать, что, несмотря на миниатюрные размеры, устройство ВФ не менее сложное, чем строение других органов и систем, и его функционирование – весьма сложно для понимания и может быть сравнимо, к примеру, с функционированием яичника – другого аналогичного органа с циклирующим механизмом развития. Миниатюрные размеры ВФ как органа определяют механизмы регулирования его функции на клеточном и молекулярярном уровнях и диктуют необходимость изучения развития патологии на местном, регионарном уровне. Морфологические изменения, происходящие в циклирующем ВФ, обусловлены тонкой настройкой межклеточных дермоэпидеральных и мезенхимальных взаимодействий, осуществляемых определёнными сигнальными молекулами, факторами роста, нейротропинами, Wnt-сигнальными путями, межклеточными цитокинами, лигандами и их рецепторами. Сложность изучения патогенеза ГА обусловлена, во-первых, отсутствием понимания природы цикличности роста здорового волоса, во-вторых

– отсутствием ясности в этиологии самой болезни и недостаточным пониманием