диссертации / 98

161

патологий, при которой локализация и распространённость клинических проявлений меняются при каждом новом эпизоде (обострении), и пациенты с «лёгкой» формой при следующем обострении могут перейти в разряд больных с «тяжёлой» формой.

Таким образом, целенаправленный сбор анамнеза и применение шкалы оценки SBN помогают адекватно оценить степень тяжести болезни и прогнозировать её течение уже при первичном приёме и осмотре пациента.

Клинико-лабораторное обследование пациентов проводили в соответствии с единым планом обследования. При осмотре важное внимание уделялось дерматоскопическим признакам ГА в очаге поражения, которые изучали с применением трихоскопа – видеодиагностического оборудования «Aramo SG», позволяющего увеличить масштаб изображения и снимков поверхности кожи в 60 и 200 раз. Дерматоскопические признаки позволяли повысить точность диагностики ГА и определить активность заболевания. В очагах облысения наблюдались жёлтые фолликулярные точки интенсивного (почти коричневого) цвета при активной ГА. Активная стадия (77 больных из 145) характеризовалась также наличием зоны расшатанных волос, в которой определялись дистрофичные волосы: пеньки стержней волос по типу головешек – короткие (1–2 мм) ниточки чёрного цвета, в виде восклицательного знака, чёрные точки кадаверизованных волос в устье фолликулов. У пациентов без признаков расширения границ очага (хроническая стадия – 68 больных из 145), помимо жёлтых точек в устье ВФ, иногда наблюдался рост одиночных пушковых депигментированных волос длиной до 2 мм. Кожа в зоне расширения границы очага была слегка гиперемирована, что связано с острым воспалением, формирующимся перибульбарно, иногда вокруг сосудов. Субъективно в активную стадию отмечались лёгкий зуд, ощущение ползания мурашек в очаге. У пациентов с хронической стадией ГА кожные покровы в очаге были обычной бледной окраски, субъективные жалобы отсутствовали.

162

Рутинные лабораторные анализы включали общий анализ крови, общий анализ мочи, развернутый биохимический анализ крови; определяли уровень аспартат- и аланинаминотрансферазы, глюкозы, белка, общего холестерина, общего билирубина, креатинина, Са++, кортизола.

При необходимости у больных исследовали гормоны щитовидной железы, проводили консультации смежных специалистов (гинеколога, эндокринолога, офтальмолога).

Поскольку нашей целью была разработка методов лечения, которые бы учитывали клинический полиморфизм ГА, изучение патогенетических аспектов, лежащих в основе нарушения гомеостаза при различной степени активности ГА не только позволяли бы уточнить особенности течения заболевания, но и определить объём и последовательность лечебных мероприятий.

В соответствии с задачами исследования биопсия кожи скальпа была проведена у 44 пациентов, в том числе у 13 – в динамике.

Гистопатологические особенности ГА не различались в зависимости от степени потери волос и общего стажа заболевания, но зависели от активности процесса и продолжительности последнего эпизода. Установлено, что особенности клинической картины заболевания коррелировали с патоморфологическими изменениями в тканях при ГА и отражали особенности патофизиологического развития заболевания. В активную стадию в очаге облысения наблюдалась небольшая гиперемия кожи, по краю очага виднелись специфические дерматоскопические признаки в виде пеньков обломанных волос, в устьях фолликулов определялись чёрные точки кадаверизованных волос или перифолликулярные жёлто-коричневые точки, иногда были видны пеньки волос в виде «головешек». При этом местные патоморфологические изменения проявлялись обильным воспалительным перифолликулярным клеточным инфильтратом, который располагался как перифолликулярно, так и вокруг сосудов, и состоял из лимфоцитов, макрофагов и других мононуклеарных

163

элементов; наблюдались дис- и паракератоз клеточного эпителия ВФ, признаки апоптоза клеток матрикса ВФ, внутриклеточный отёк, разрыхление коллагеновых волокон, утолщение стенок сосудов, расширение устьев фолликулов, дистрофичный анаген или отсутсвие волос в ВФ.

В хроническую стадию кожа в очаге облысения была бледная, признаки расширения границ очага отсутствовали, при дерматоскопии определялись жёлтокоричневые точки в пустых устьях ВФ. Патоморфологические особенности при хронической ГА характеризовались снижением количества ВФ, их атрофией, в отдельных образцах вокруг сосудов дермы и перифолликулярно наблюдались слабая инфильтрация из гистиоцитов и лимфоцитов, умеренно выраженный перифолликулярный и периваскулярный склероз, умеренно выраженное утолщение коллагеновых волокон с уменьшением отека тканей и выраженным уплотнением стенок сосудов. Накопление экстрацеллюлярного матрикса в хроническую стадию включало коллагеновые волокна, фибробластические элементы и единичные склерозированные сосуды, склероз дермы. Можно сказать, что местное воспаление в активной стадии ГА со временем переходит в процессы регенерации и склероза. Явления фиброзирования и умеренного склероза усиливаются по мере длительности существования очагов алопеции и больше выражены у пациентов с длительностью последнего эпизода >2 лет.

Наши данные согласуются с результатами отечественных и зарубежных исследователей [5, 21, 88] и, в частности, совпадают с выводами D. Whiting [262], который также отмечал, что гистологические особенности при ГА не зависят от пола, возраста или расы пациента, от клинического типа и процента потери волос, общей продолжительности ГА или регресса; основным фактором, влияющим на гистопатологические особенности, является продолжительность текущего эпизода заболевания. В то же время диагноз ГА следует предполагать даже при отсутствии перибульбарного лимфоцитарного инфильтрата, если обнаруживается высокое содержание телогеновых или миниатюризированных волос.

164

Для анализа иммунного инфильтрата вокруг ВФ при ГА и определения состояния гомеостаза мы использовали метод ИГХ. Это позволило исследовать тканевую иммунную реакцию на ранних (до 2–3 мес) и поздних (с персистенцией до 6 лет) этапах заболевания.

ИГХ-исследование показало, что с прекращением активности ГА наблюдается уменьшение воспалительного клеточного инфильтрата с 5,7 балла в активную стадию до 2,3 балла (р=0,01). При этом в более ранних исследованиях мы определили, что происходит не только уменьшение содержания, но и перераспределение клеток воспалительного инфильтрата: в активную стадию инфильтрат состоял в основном из CD8+, CD68+ и в меньшей степени – CD4+- клеток, которые окружали сосуды и располагались не только вокруг клеток фолликула, но и пенетрировали в НЭВК волоса. В случае длительной персистенции очагов алопеции в инфильтрате начинали преобладать тканевые CD68+-макрофаги и повышалось соотношение CD4/CD8, в основном за счёт значительного сокращения CD8+-клеток и уменьшения количества CD4+-клеток

[9, 17].

Детальное исследование позволило нам установить ключевые механизмы дисморфогенеза ВФ при ГА, оказывающие особое воздействие при активной стадии ГА.

При развитии нормального ВФ активные митотические процессы в катагеновой фазе сменяются регрессией отдельных его частей посредством апоптоза, который сам по себе поддерживает эпителиальный регресс здорового волоса [45, 46].

В нашем исследовании в контроле (здоровые доноры) мы определяли только до 0,1‰ апоптозных клеток, в то время как в образцах с ГА среди клеток эпителия НЭВК в зоне утолщения bulge (зоне стволовых клеток) и в нижней части ВФ выявлялось до 33‰ клеток в состоянии апоптоза.

Мы выяснили распределение медиаторов запуска апоптоза при ГА. Антиген

165

Fas - мембранный белок, участвующий в апоптозе; он принадлежит к большому суперсемейству рецепторов факторов роста нервов/некроза опухолей - мы обнаружили на кератиноцитах ВФ при ГА (в контроле – в виде одиночных Fas+- клеток). Полученные в ходе исследования данные в контроле совпадают с более ранними исследованиями других авторов, которые также обнаруживали Fas+-клетки на культурах кератиноцитов [214] и в ВФ мыши, где экспрессия Fas/Apo1, p55 TNFR

ир75 NTR (3 связанных с апоптозом рецепторов) выявлялась в эпителии не циркулирующего дистального отдела фолликула в течение всего периода развития волоса [148].

На кератиноцитах ВФ с ГА выявлялось 88% клеток с Fas/Apo-рецепторами

CD95.

Роль индукторов Fas-рецептора на поверхности клеток ВФ могут играть эффекторные цитокины активированных Т-лимфоцитов – IL2, TFNα, IFNγ, экспрессия которых значительно выражена в активную фазу ГА [108, 111]. Мы обнаружили 55% FasL+-клеток в воспалительном инфильтрате. Т.е. можно сказать, что цитотоксические Т-клетки CD8+, которые играют активную роль в патогенезе ГА, действуют через апоптотические механизмы, зависимые в том числе от Fas-FasL-путей. Это совпадает с результатами исследований C. Bodemer

исоавт., касающихся цитотоксичности Т-клеток при ГА, которые могут обладать как гранзимом В, так и Fas/FasL-цитотоксическими механизмами [42]. О важности Fas-FasL-пути апоптоза свидетельствует отсутствие ГА у мышей линии

C3H/HeJ с дефицитом Fas или FasL [85].

Полученные нами данные позволяют утверждать, что взаимодействие FasFasL занимает важное место в патогенезе ГА у человека. В то же время экспрессия этого белка не является строго специфичной для ГА. ИГХ-методами антиген Fas определяется на кератиноцитах поврежденного эпидермиса и при некоторых других патологических состояниях человека: лихеноидных лекарственных высыпаниях, мультиформной эритеме, контактном дерматите,

166

буллезном пемфигоиде.

В образцах ткани с ГА нам не удалось обнаружить CD25/IL2Rα+-клетки ни при активном, ни при хроническом течении ГА, в то время как в контроле единичные CD25/IL2Rα+-клетки обнаруживались. По данным литературы, поддержание цитотоксических реакций и отсутствие Fas-опосредованного апоптоза лимфоцитов становится возможным при нарушении естественных иммунорегуляторных механизмов защиты, в частности, в случае недостаточности продукции цитокина IL2 или отсутствия его рецептора [18]. О способности управлять аутореактивными Т-клетками в условиях in vivo незначительной популяции CD4+-T-клеток, приблизительно 10%, коэкспрессированнной с рецептором IL2 (IL2R) α-цепью (CD25), писали S. Sakaguchi и соавт. [211].

Т-регулирующие CD4+CD25+-клетки (Treg) первоначально обнаружены у мышей; позже популяция клеток с идентичными фенотипическими и функциональными свойствами была выявлена и у человека [118]. В случае экспрессии на поверхности регуляторных активированных CD4+-Т-клеток рецептора для IL2 проявляется их способность к модуляции иммунного ответа, и CD4+CD25+-лимфоциты (Тreg) проявляют супрессорную активность, участвуя в апоптозе клеток. Логично предположить, что дисфункция в пределах регуляторных субпопуляций клеток вносит существенный вклад в развитие склонности к аутоиммунным болезням. Идентификация и описание характера дисфункциональных Treg-клеток при некоторых болезнях человека, включая псориаз, рассеянный склероз, аутоиммунный полигландулярный синдром типа 1, дают основание полагать, что при неизмененной функции эти клетки могут играть важную роль в профилактике аутоиммунных заболеваний [130, 233, 243]. Исследования, проведенные на моделях мышей C3H/HeJ с ГА, выявили низкий уровень Treg-клеток в их коже. Инъекции этих клеток мышам C3H/HeJ подавляют у них индукцию CD4+CD25--T-клеток и предотвращают местное выпадение волос под влиянием CD8+-Т-клеток. При этом мыши, получающие Treg-клетки, не

167

заболевают ГА [253].

Таким образом, отсутствие в нашем исследовании экспрессии рецептора CD25/IL2Rα+ на поверхности клеток во всех образцах с ГА может служить одним из возможных объяснений персистенции аутореактивных Т-лимфоцитов в очагах ГА и свидетельствовать в пользу аутоиммунизации при ГА. Возможно, именно этот факт обусловливает частое сочетание ГА с другими аутоиммунными заболеваниями. В любом случае понятно, что отсутствие Treg-клеток в очаге, возможное в условиях понижения их активности или другой дисфункции, способствует развитию ГА, и что для успеха лечения ГА необходимо поддерживать должную активность Treg-клеток. Вместе с тем следует отметить, что механизм самотолерантности иммунной системы, обеспечиваемый Tregклетками, нуждается в дальнейшем изучении.

ИГХ-методом нами обнаружено, что в контроле состояние тканевого гомеостаза в здоровом анагеновом ВФ поддерживается за счёт балланса между процессами пролиферации и дифференцировки, формируемого при контроле программируемой клеточной гибели с участием противоапоптозного белка bcl-2, который мы выявляли в клетках матричной зоны ВФ. В фолликулярном эпителии было обнаружено до 26% CК15+-клеток, 16% Ki67+-клеток, 29% bcl-2+-клеток при почти не определяемых TUNEL+- клетках Аро (0,09‰).

Вобразцах здоровой ткани мы выявили до 2,7% VEGF+-клеток в эпителии дермального сосочка ВФ. Невысокий уровень этого белка, возможно, обусловлен тем, что усиление экспрессии VEGF и восстановление васкуляризации наблюдается в основном на ранних этапах анагена [271], а в нашем контроле ВФ в ранней фазе анагена отсутствовали.

Дальнейшие исследования были направлены на изучение особенностей нарушений тканевого гомеостаза при ГА. Было выявлено, что степень нарушений имела прямую корреляцию с активностью заболевания.

Вактивную стадию заболевания CK15+-клетки, которые были

168

использованы в качестве маркёров дифференцировки, отсутствовали в фоллликулярном эпителии, но выявлялись в базальном слое покровного эпителия. В эту же стадию наблюдалось уменьшение количества Ki67+-клеток до 4,6%, которые обнаруживались в основании ВФ и в базальном слое эпидермиса. Отсутствие bcl-2+-клеток в эпителиоцитах ВФ, в свою очередь, свидетельствовало о снижении пролиферативной активности – этот антиапоптозный маркёр мы также рассматривалии как один из критериев пролиферации.

Повышенная экспрессия молекул VEGF, секретируемых макрофагальными элементами воспалительного инфильтрата и отчасти эндотелием предсуществующих сосудов в активную стадию ГА (до 12% клеток каждого типа), свидетельствовала об образовании сосудов капиллярного типа, что, по сути, может закладывать базу для последующей репарации. Между тем Г.Е. Сагиндикова и соавт. [19] продемонстрировали связь между процессами неоангиогенза, повышенной экспрессией VEGF и фиброзированием ткани.

О том, что чрезмерный ангиогенез может способствовать склерозу, писал в 1987 г. Д.С. Саркисов [20]. Поэтому мы полагаем, что факт избыточной экспрессии VEGF в активную стадию необходимо учитывать при выборе тактики лечения ГА.

В хроническую стадию ГА мы отметили уменьшение интенсивности воспаления до 2,3 балла, всё меньше обнаруживается лимфоцитов, макрофагов и клеток Лангерганса вокруг вовлечённых в патологический процесс ВФ. Численность клеток все еще выше, чем у людей без ГА, но даже это небольшое количество клеток обеспечивает контроль со стороны иммунной системы над вовлечёнными в патологический процесс ВФ.

Снижение активности воспалительного процесса сопровождалось тенденцией к восстановлению тканевого гомеостаза. Уровень апоптоза носил менее выраженный характер. TUNEL-тест выявлял единичные апоптозные тельца (1,3), единичные воспалительные клетки с FasL (1,3) в скудном воспалительном

169

инфильтрате и умеренное количество СD95+-эпителиоцитов – в основном на поверхности клеток внутренней оболочки корня волоса (до 24%).

Мы связали это с выраженной деструкцией волосяного волокна, вследствие чего стимуляция иммунной системы со стороны неизвестных антигенов ВФ становится всё меньше. Клинические признаки снижения активности патологического процесса в виде прекращения расширения границ очага сопровождались уменьшением плотности воспалительного инфильтрата (среди клеток которого преобладали тканевые макрофаги – ведущие клетки процессов регенерации тканей), выраженным снижением детекции апоптозных телец, отсутствием VEGF+-клеток в дерме, но сохранением их небольшого количества в эпителиоцитах дермального сосочка, появлением в матричной зоне ВФ небольшого количества Кi67+, bcl-2+ и CK15+-клеток. Кроме того, синтезирующие СК15+-эпителиоциты появлялись в области, включающей зону bulge. Всё вместе это свидетельствовало о процессах частичной репарации в ВФ.

Вместе с тем при продолжительности заболевания >2 лет процессы репарации ВФ сопровождаются его атрофией с развитием склеротических изменений и накоплением фибробластических элементов, компонентов экстрацеллюлярного матрикса, в том числе коллагеновых волокон, а также склерозированием микрососудов.

Таким образом, в ходе проведённых исследований было установлено, что ГА медиированна Т-клеточным ответом, который формируется в условиях недостаточной функции иммунорегуляторных механизмов, призванных контролировать степень ответа Т-лимфоцитов на активирующие стимулы, формирующиеся, в частности, в условиях отсутствия в тканях CD25/IL2Rα+- клеток. Нарушение гомеостаза в тканях с ГА в активную стадию заболевания проявляется значительным усилением процессов апоптоза и повреждением инфундибулярной части ВФ посредством его Fas-FasL-путей, прекращением

170

процессов дифференцировки и снижением пролиферативной активности клеток эпителиальной выстилки ВФ. В то же время в активную стадию наблюдается повышенная экспрессия молекул VEGF, секретируемых макрофагальными элементами воспалительного инфильтрата и, отчасти, эндотелием предсуществующих сосудов, что свидетельствует об образовании сосудов капиллярного типа и может закладывать базу для последующей репарации.

В хронической стадии ГА наблюдаются снижение плотности воспалительного инфильтрата, перераспределение его клеточного состава с преобладанием тканевых CD68+-макрофагов и изменения гомеостаза повреждённой ткани, свидетельствующие о тенденции к репаративным процессам. Уровень клеток в состоянии апоптоза снижается до 1,3‰, появляются bcl-2+-клетки, в ВФ увеличивается количество Ki67+-клеток, почти достигая уровня в контроле (соответственно 16% и 9,4%), что свидетельстует об усилении процессов пролиферации; появляются дифференцирующиеся CK15+-клетки, в дерме перестают определяться VEGF+-клетки, вероятно, из-за резкого уменьшения воспалительного инфильтрата; их количество в эпителиальных клетках дермального сосочка ВФ сокращается.

Самостоятельную тенденцию к восстановлению гомеостаза при хронической ГА мы объясняем воздействием механизмов репарации, заложенных в самом фолликуле. Об этом свидетельствует появление в матричной зоне ВФ противоапоптозных bcl-2+-клеток – включаются генные механизмы сохранения пула прогенераторных клеток, как и в неизмененном ВФ, где bcl-2 выражен в фолликулярном сосочке, а также в смежном с ним матричном эпителии на всех стадиях цикла, и его модальная экспрессия в фолликулярном эпителии снижается только в фазу катагена [148]. Экспрессия bcl-2 защищает клетки от программируемой клеточной гибели и потому крайне важна для последующего роста волос.