диссертации / 31

хромагена использовали раствор тетраметилбензидина с Н202. Регистрацию проводили на длине волны 450 нм с помощью ИФА-анализатора («ЭФОС»,

Россия). Результаты сывороточной иммунореактивности анализируемых проб, полученные в единицах оптической плотности, пересчитывали по отношению к иммунореактивности сыворотки «внутреннего стандарта» с

теми же антигенами и выражали в процентах от уровня реакции стандарта

(условные единицы).

Критерии «нормы реакции» по данным лаборатории, были определены с учѐтом возраста пациентов и представлены следующими диапазонами значений:

-40 … -10 усл.ед. – для детей от 2 до 6 лет.

-40 … 0 усл.ед. – для детей от 7 до 10 лет

-30 … +10 усл.ед. – для детей от 11 до 16 лет.

Определение сывороточного содержания естественных кардиотропных аутоантител и интерпретация полученных результатов проводились согласно требованиям методики группы ЭЛИ-Кардио-Тест и личном участии д.м.н.

проф. А. Б. Полетаева.

С целью выявления степени и характера инфицированности детей с

НРСиП вирусами семейства Herpesviridae в сыворотке крови 84 пациентов

(62 ребѐнка с НРСиП и 22 ребѐнка без аритмии) методом иммуноферментного анализа (ИФА) определялись серологические маркѐры

(уровни антител (АТ) класса IgM и IgG) вирусов простого герпеса 1,2 типов

(НSV 1,2 типов), цитомегаловируса (CMV), Эпштейн-Барр вируса (EBV),

вируса герпеса 6 типа (ННV6)). Исследования проводились на базе лаборатории МИЦ «Иммункулус» (Москва).

У всех детей были определены уровни антител (АТ) класса IgM и IgG

к НSV 1,2 типов, CMV, IgM к капсидному антигену (VCA) EBV и IgG к

ядерному антигену (ЕВNA) EBV, IgG ННV6.

61

Применялись тест-системы «Вектор Бест» г. Новосибирск. Данные тест системы (вектоВПГ-IgM, вектоВПГ-IgG-стрип; вектоЦМВ-IgM (основной реагент - рекомбинантные антигены ЦМВ), вектоЦМВ-IgG-стрип (основной реагент - очищенный рекомбинантный антиген ЦМВ); вектоВЭБ-VCA-IgM

(основной реагент - очищенный рекомбинантный белокVCA-18), вектоВЭБ- NA-IgG IgM (основной реагент - очищенный рекомбинантный белок ЕВNA-

1р72); вектоННV-6-IgG (основной реагент - очищенные рекомбинантные белки р41 и р100)) предназначены для выявления соответствующих иммуноглобулинов в сыворотке (плазме) крови человека и могут быть использованы для диагностики первичной и рецидивирующей герпетической инфекции.

Суть процесса:

На первой стадии процесса образцы инкубируются в лунках планшета с иммобилизированными антигенами. Антитела связываются с антигенами,

несвязавшийся материал удаляется отмывкой. Связавшиеся АТ выявляют при инкубации с конъюгатом АТ к АГ сыворотки с пероксидазой хрена.

После второй отмывки количество связавшегося конъюгата определяют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Реакцию останавливают добавлением стоп-реагента и измеряют оптическую плотность.

Для большей достоверности все исследования были поставлены в дублях.

Методика:

Приготовление реагентов:

После 30 минутной выдержки при комнатной температуре,

цефленовый пакет со стрипами вскрывается, после чего стрипы готовы к использованию.

Исследуемые сыворотки разводятся в 10 раз готовым раствором для разведения сывороток (РРС). Для этого в лунки вспомогательного планшета вносится по 90 мкл раствора для разведения сывороток и добавляется по 10

62

мкл цельной сыворотки, при тщательном перемешивании, при этом малиновый цвет раствора меняется на жѐлтый.

Для отмывки планшетов в соответствие с инструкцией готовится

необходимое количество фосфатного буфера (ФСБ-Т).

Для приготовления раствора конъюгата (РК) используются раствор

для разведения конъюгата (РРК) и конъюгат, соотношение которых,

указано в инструкции.

Для приготовления раствора тетраметилбензидина (раствор ТМБ) в

соответствующих пропорциях соединяется концентрат ТМБ и субстратный буферный раствор (СБР).

В лунку А-1 планшета с иммобилизированным антигеном вносят 100мкл РРС. Лунка А-1 является контролем поглощения раствора ТМБ. В лунки В-1,

С-1 и D-1 вносится по 100 мкл отрицательного контрольного образца

остальные лунки вносится по 90 мкл РРС и по 10 мкл предварительно разведенных исследуемых сывороток. Перемешивание осуществляется

пипетированием. Закрытый плѐнкой планшет инкубируется при

t(37.5±0.5)°С в течение 30±3 мин. После окончания инкубации стрипы

необходимо промыть. Используя вошер, осуществляется 5-кратная

отмывка в растворе ФСБ. В каждую лунку стрипа кроме А-1 вносится по

100 мкл раствора конъюгата, в лунку А-1 вносится 100мкл РРК. Закрытый плѐнкой планшет инкубируется при t(37.5±0.5)°С в течение 30±3 мин. По

темноте 25 мин. при 18-25°С. Реакция останавливается добавлением в лунки стоп-реагента.

Результаты ИФА регистрируются с помощью спектрофотометра. При этом измеряется оптическая плотность в двухволновом режиме: основной

63

фильтр – 450нм, рефренс-фильтр – в диапазоне 620-650 нм. Калибровка спектрофотометра осуществлялась по воздуху.

Методика выполнения ИФА с применением тест-систем «Вектор Бест» идентична для всех типов герпесвирусов. Оценка же результатов зависит от типа вируса.

Для того чтобы проводить оценку результатов, необходимо было удостовериться в корректности проведѐнного исследования. Качество тест-

системы считается удовлетворительным, если оптическая плотность (ОП)

контроля поглощения без конъюгата (лунка А-1) не превышает 0.1 о.е., (оптических единиц) среднее значение ОП в лунках с отрицательным контрольным образцом (ОПср К- ) не превышает 0.250 о.е. ( для ВПГ IgG 0.20

о.е.), среднее значение ОП в лунках с положительным контрольным образцом (ОПср К+ ) не менее чем в три раза превышает ОПср К-.

При оценке корректности проведения исследования все пробы были признаны удовлетворительными.

Для оценки результатов анализов вычисляют контрольный уровень оптической плотности ОПкрит. Для каждого типа вируса ОПкрит определяется по соответствующей формуле:

НSV 1,2 - IgM ОПкрит = ОПср К- + 0.20

Положительными считают пробы с ОП>ОПкрит +10%

Отрицательными считают пробы с ОП<ОПкрит -10%

Пробы имеющие оптическую плотность, входящую в интервал ОПкрит±10%

считают сомнительными.

- IgG ОПкрит = ОПср К- + 0.10

Диагностические значения оптической плотности для HSV 1,2:

IgM - 0.3 о.е., IgG - 0.11 о. е.,

(согласно рекомендациям производителя тестсистем показатели IgG менее

0.90 о.е. расценены как умеренное превышение диагностических титров,

показатели IgG более 0.90 о.е. – как резкое);

64

CMV - IgM ОПкрит = ОПср К- + 0.30

Положительными считают пробы с ОП>ОПкрит +10%.

Отрицательными считают пробы с ОП<ОПкрит -10%.

Пробы, имеющие оптическую плотность, входящую в интервал ОПкрит±10% считают сомнительными.

- IgG ОПкрит = ОПср К- + 0.10

Диагностические значения оптической плотности для CMV:

IgM - 0.45 о.е., IgG - 0.15 о. е.,

(согласно рекомендациям производителя тестсистем показатели IgG менее

- IgG ОПкрит = ОПср К- + 0.10

Положительными считают пробы с ОП>0.9*ОПкрит Отрицательными считают пробы с ОП<1.4*ОПкрит Пробы, имеющие оптическую плотность, входящую в интервал

0.9*ОПкрит - 1.4*ОПкрит считают сомнительными

Диагностические значения оптической плотности для EBV:

IgM - 0.25 о.е., IgG - 0.18 о. е.,

(согласно рекомендациям производителя тестсистем показатели IgG менее

1.25 о.е. расценено как умеренное превышение диагностических титров,

показатели IgG более 1.25 о.е. – как резкое);

ННV-6 - IgG ОПкрит = ОПср К- + 0.20

Положительными считают пробы с ОП>0.9*ОПкрит Отрицательными считают пробы с ОП<1.15*ОПкрит Пробы, имеющие оптическую плотность, входящую в интервал

0.9*ОПкрит - 1.15*ОПкрит считают сомнительными.

Диагностические значения оптической плотности IgG для ННV6 - 0.28 о. е.

65

(согласно рекомендациям производителя тестсистем показатели IgG менее

1.45 о.е. расценено как умеренное превышение диагностических титров,

показатели IgG более 1.45 о.е. – как резкое).

Об инфицированности судили на основании выявления специфических

антител. Согласно имеющимся в научных работах рекомендациям,

первичная инфицированность (острая инфекция) устанавливалась при наличии диагностически значимых показателей специфических IgM.

Одновременное обнаружение диагностически значимых показателей специфических IgM и IgG расценивалось как реактивация персистирующей

инфекции. Выявление умеренного повышения показателей IgG

расценивалось как свидетельство анамнестически отдалѐнной латентной инфекции, а резко высокие показатели IgG - как маркѐры хронической персистирующей инфекции или анамнестически близкого инфицирования

[16, 83, 154, 155]

Статистическая обработка данных проводилась с использованием непараметрических методов вариационной статистики (программное обеспечение – STATISTIKA 6.0.). Средние величины представлены с указанием стандартных среднеквадратичных отклонений (М±m). Для определения статистической значимости различий в частоте встречаемости анализируемых признаков в изучаемых группах применялись коэффициент Стъюдента (t) для абсолютных величин и критерий соответствия χ2 для относительных величин, df – число степеней свободы.

66

Глава III. Клиническая характеристика обследованных детей c нарушением ритма сердца и проводимости и без аритмии.

III. 1. Клинико-анамнестическая характеристика.

Анализ клинико-анамнестических данных осуществлялся на основании изучения особенностей акушерско-гинекологического анамнеза матерей пациентов, распространѐнности среди детей всех групп инфекционных и соматических заболеваний, характера субъективных жалоб пациентов.

III. 1.1. Клинико-анамнестическая характеристика детей c нарушением ритма сердца и проводимости.

Осложнѐнный акушерско-гинекологический анамнез имели 49(63.7%)

матерей детей с НРСиП (Табл.2). Ни одна из женщин не была обследована на носительство внутриутробных инфекций ИФА методом. Неблагоприятное

течение беременности отмечено у 35(45.5%) матерей, патология родов у

29(37.7%) беременных. Сочетанные осложнения беременности и родов

Преждевременными роды были у 2(2.6%) женщин, запоздалыми у одной.

Слабость родовых сил, со стимуляцией родовой деятельности отмечалась у 8 (10.4%) женщин, у 3(3.9%) из них сопровождалась длительным безводным

беременным (Табл. 2).

67

Таблица 2. Сравнительная характеристика осложнений беременности и

родов у матерей обследованных детей в различных группах.

Ранний неонатальный период 16(20.8%) детей характеризовался церебральной ишемией I-II степени, развившейся вследствии тяжѐлых

гипоксически-травматических перинатальных осложнений: гипоксии плода

16(20.8%), асфиксии в родах 10(13.0%), связанной у 3(3.9%)

новорожденных с тугим 2-3-кратным обвитием пуповины и потребовавшей

Анализ анамнестических данных о распространѐнности инфекционных и соматических заболеваний в группе детей с НРСиП выявил высокую частоту инфекционных заболеваний у одной трети пациентов (используются

кретерии оценки частоты заболеваемости согласно рекомендациям В. Ю.

Альбицкого, А. А., Баранова 2003г. [6]): частые респираторные инфекции

(35.1%), хр. тонзиллит (29.9%), ангины (14.3%), пневмонии (10.4%) (Табл. 3).

Анализ инфекционной заболеваемости также показал высокую частоту

встречаемости детских вирусных инфекций с преобладанием ветряной оспы

(50.6%) и краснухи (26.0%). Среди детей с аритмиями у 30% в анамнезе

имели место различные проявления стрептококковой инфекции, у половины

путей, реактивный панкреатит, хр. гастродуоденит). У 9 (11.7%) детей в анамнезе имелись указания на патологию почек. Аллергоанамнез был отягощѐн у 22% детей и характеризовался абсолютным преобладанием пищевой аллергии, с развитием у 8 пациентов атопического дерматита. У 4

детей имел место поллиноз, с развитием бронхиальной астмы у 2.

Сотрясение головного мозга в анамнезе верифицировано у 7 (9.1%) детей.

69

Таблица 3. Частота встречаемости различных соматических и

инфекционных заболеваний в группе детей с НРСиП.

При изучении анамнеза настоящего заболевания выяснилось, что более чем у половины 42(54.%) пациентов нарушение ритма было выявлено впервые, при этом у 29(37.7%) детей – во время данной госпитализации,

непосредственно перед госпитализацией амбулаторно – у 13(16.9%) детей. 18(23.4%) детей уже находились под наблюдением кардиолога в связи с ранее

выявленными изменениями на ЭКГ: сроком менее 6 мес. –1 ребѐнок, от 6 до

70