диссертации / 17

71

курения / 20. Показатель «пачка/годы» (количество лет курения, умноженное на среднее число пачек сигарет, выкуренных в месяц, и умноженное на 12 мес) ввиду не столь большого стажа наилучшим образом отражает кумулятивный эффект курения у подростков.

Клинические особенности течения бронхиальной астмы детально проанализированы у 42 подростков с обострением болезни, лечившихся в Краевой клинической больнице №2 г Читы. Дизайн: ретроспективное сравнительное исследование, построенное по принципу копи-пара (сравниваемые больные были идентичны по полу, возрасту, степени тяжести астмы, социальному статусу). Группы различались только в отношении активного курения (21 курящий и 21 некурящий). Из клинических показателей оценивали частоту приступов бронхиальной астмы, триггеры и причинно-значимые аллергены, вызывающие обострение, динамику АСТ-теста; инструментальные данные пикфлоуметрии, рентгенографии органов грудной клетки, ЭКГ, ФВД в пробе с бронхолитиком; лабораторные показатели гемограммы, риноцитограммы, ИФА на атипичные возбудители, общего IgE; результаты кожных скарификационных проб. При динамическом наблюдении за больными во время приступного периода каждые 24 часа учитывали выраженность клинических симптомов (в баллах от 0 до 3), данные динамической пифлоуметрии. Оценивали объём проводимой бронхолитической, противовоспалительной, антибактериальной, муколитической, симптоматической терапии.

Проведена комплексная оценка эффективности растительных ингибиторов лейкотриенов (босвеллиевых кислот) у подростков с бронхиальной астмой. Использован препарат «Бронходиол» (БАД, ОАО «Диод», Москва). Дизайн исследования: двойное, слепое, сравнительное, плацебо контролируемое, с 3 месячным катамнезом. Все дети проходили курс реабилитации в амбулаторных условиях.

Критериями включения были: возраст 12-18 лет; наличие установленного у детей диагноза легкой или средней тяжести бронхиальной астмы; согласие детей и их родителей на участие в исследовании; отсутствие тяжёлых сопутствующих

72

заболеваний, делающих неприемлемым участие в исследовании, а также отсутствие в анамнезе аллергических реакций на ингредиенты, входящие в состав препарата.

Группа составила 44 больных бронхиальной астмой в возрасте 12-18 лет

(средний возраст 14,9±0,28 лет), в т.ч. 23 девушки и 21 юноша. Бронхиальная аст-

ма средней тяжести определена у 7 подростков; легкой степени тяжести - у 37 (интермиттирующее течение - у 24 и персистирующее - у 13). У 25 человек имел-

ся сопутствующий аллергический ринит. Все больные рандомизированы методом случайной выборки. Из них получали Плацебо - 21, Бронходиол - 23 подростка.

Возрастно-половой состав исследуемых групп и исходные клинико-

инструментальные показатели не отличались. Бронходиол применялся в рекомен-

дованных дозах (по 2 капсулы 3 раза в день) в течение 21 дня, аналогично - Пла-

цебо. Из клинических показателей оценивали частоту приступов бронхиальной астмы, динамику АСТ-теста, побочные эффекты в виде непереносимости препа-

рата, аллергических реакций, негативных субъективных ощущений. Оценку про-

водили через 3 недели лечения (на 21-й день) и в катамнезе через 3 месяца.

В качестве мукорегулятора у подростков с БА использовали лизиновую соль карбоцистеина (Флуифорт). Обследовали 23 подростка (18 – с легкой, 5 -

среднетяжелой БА) в возрасте 12-18 лет с обострением бронхиальной астмы на фоне ОРВИ. Подростков с ОРВИ разделили на 2 группы: в первую группу вошли

11 активно курящих подростков c бронхиальной астмой; во вторую группу – 12

некурящих подростков.

Критериями включения в исследование были: возраст подростков от 12 до

18 лет; наличие обострения бронхиальной астмы легкой и средней степени тяжести на фоне ОРИ; наличие информированного согласия родителей, а также самих подростков (в возрасте старше 15 лет).

Критериями исключения из исследования были: наличие сопутствующих хронических заболеваний печени, почек; указания в анамнезе на аллергические реакции на препараты карбоцистеина; отсутствие информированного согласия подростков и их родителей.

73

Всем подросткам проведены общеклинические обследования (анамнез,

осмотр и др.). Выраженность клинических симптомов определяли по специально разработанной шкале, которая включала: оценку (в баллах от 0 до 3)

выраженности температуры тела, одышки, кашля с отделением мокроты, хрипов в легких, затруднения носового дыхания, интенсивности патологических выделений из носа. Динамику клинических симптомов проводили в течение первых 7 дней лечения ежедневно, затем на 10-й, 14-й и 21-й день.

Все пациенты получали общепринятое лечение, включая диетотерапию,

этиотропное лечение (противовирусные, антибактериальные средства),

физиотерапию (ингаляции 0,9% раствора хлорида натрия), массаж и др. По показаниям назначали базисную (противовоспалительную) терапию. Наряду с общепринятым лечением подростки получали в качестве муколитика лизиновую соль карбоцистеина - ЛКЦ (Флуифорт, «Домпе Фармачеутичи С.п.А», Италия).

Препарат (в виде сиропа) назначали в рекомендованной возрастной дозировке: от

12 до 15 лет по 10 мл 2-3 раза в день, старше 15 лет – по 15 мл 2 раза в день.

Длительность курса лечения составила 7 дней.

Для аллергодиагностики использовали скарификационные пробы со стан-

дартным набором аллергенов: бытовых (домашняя пыль), эпидермальных (шерсть кошки, собаки, морской свинки), пыльцевых (береза, ольха, полынь, овсяница,

тимофеевка, ежа, орешник) (Ставрополь, Россия); определение общего IgE мето-

дом твердофазного ИФА с применением наборов реагентов ЗАО «Вектор-Бест»

(г. Новосибирск).

Функциональные методы исследования включали оценку функции внеш-

него дыхания на приборе (MiniSpir User Manual, Италия). Для оценки обратимо-

сти бронхиальной обструкции проводили фармакологическую пробу с сальбута-

молом в соответствии с действующими рекомендациями [62, 91].

Для подтверждения активного курения определяли содержание монооксида углерода (СО) в выдыхаемом воздухе с помощью СО-анализатора «Micro CO»,

(Smoke Check - МICRO МEDICAL LTD., Великобритания). СО в выдыхаемом воздухе исследовали у 104 больных БА, из них 60 курящих и 44 некурящих.

74

Полуколичественные измерения прибора интерпретировались следующим образом: значения 0-6 ppm соответствовали низкому уровню (присущему некурящим) и обозначались в баллах, как 1; 7-10 ppm – среднему уровню – 2; 1120 - высокому уровню – 3; более 20 ppm – очень высокому уровню – 4 балла.

Лабораторные методы исследования.

Определение концентрации провоспалительных цитокинов IFN-γ, IL-8, TNFα и противовоспалительного IL-4 у больных БА (n=81) выполнено методом твердофазного ИФА с помощью двойных антител и применением пероксидазы хрена с использованием наборов реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Определение показателей секреторного иммуноглобулина А (sIgA) прово-

дили в смешанной слюне, собранной у детей, больных БА (n=97), натощак, без стимуляции, в количестве 5 мл. Использовали набор реагентов ЗАО «Вектор-

Бест» (г. Новосибирск).

Определение котинина в моче у 60 курящих и 44 некурящих больных БА проводили с помощью тест-полосок «ИммуноХром—КОТИНИН—Экспресс»

(производства ООО «Производственные Био-Медицинские Технологии»,

Москва).

2.3 Молекулярно-генетические методы исследования.

Выделение ДНК. Материалом для исследования послужила тотальная геномная ДНК, выделенная из образцов цельной венозной крови. Выделение тотальной ДНК проводили с помощью неэнзиматического метода [231, 247].

Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом полимеразной цепной реакции на программируемом термоциклере МС2

производства фирмы “ДНК-технология” (Россия) с использованием ДНК-

полимеразы Biotaq (“БиоМастер”) и олигонуклеотидных праймеров, которые синтезировались в НПО «Литех» (Россия). Изучение полиморфизма генов FCER2

(T2206C), NOS2 (VNTR), GSDMB (rs7216389) и CHRNA5 (rs16969968) проводили методом ПЦР с последующим ПДРФ анализом с использованием праймеров для генотипирования, разработанных в лаборатории генетической эпидемиологии МГНЦ (табл. 9).

75

Таблица 9. Тип полиморфизма, последовательности праймеров и

номенклатура аллелей анализируемых ДНК-локусов

Генотипирование полиморфизма генов GSTM1del, TNFA (-308G>A), ADRB2

(Arg16Gly) и (Gln27Glu), NOS3 (VNTR), GSDMB (rs2305480) и THOI (STR)

проводили согласно общепринятым методикам [53, 86, 214, 295, 319, 408].

Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с

76

последующим окрашиванием раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы Vilber Lourmat (Франция) в УФ-свете. В

работе использовались эндонуклеазы производства Fermentas (Литва), «Сибэнзим» (Россия).

Для оценки частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов-

кандидатов развития бронхиальной астмы (FCER2, ADRB2, TNFA, GSTM1, NOS2

и NOS3, GSDMB) и генов-кандидатов предрасположенности к табакокурению

(TH, CHRNA5) из жителей Агинского бурятского округа Забайкальского края сформирована выборка (254 человек), включающая индивидов двух подтвер-

жденных этнических принадлежностей: русские (n =86), буряты (n =168).

Для проведения анализа ассоциации генов-кандидатов с бронхиальной аст-

мой сформированы группы, подобранные по принципу «случай-контроль» с учё-

том этнической принадлежности, полового диморфизма и влияния факторов сре-

ды (табакокурения).

В качестве контроля (n=150) исследована ДНК 100 подростков бурятской и

50 русской популяции без отягощенной наследственности по атопическим забо-

леваниям и без проявлений аллергических заболеваний. Среди больных бронхи-

альной астмой (n=104) обследовано 68 бурят и 36 русских.

При анализе гендерных различий у больных БА/здоровых составлены сле-

дующие группы – буряты: юноши - 31/54, девушки - 37/46; русские: юноши -

15/23, девушки - 21/27.

Влияние табакокурения на течение бронхиальной астмы проанализировали у 49 курящих больных подростков в сравнении с курящими здоровыми (75) (ОШ f+) и у 55 некурящих больных БА в сравнении с некурящим контролем (75) (ОШ f-).

Проведен сравнительный генетический анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов-кандидатов у больных БА в зависимости от степени тяжести за-

болевания - легкая/средней степени тяжести у бурят - 61/7, у русских - 29/7; ма-

нифестации заболевания до 6 лет/и после 6 лет у бурят - 38/30, у русских - 21/15;

77

содержанию общего IgE в крови выше 100 МЕ/мл и ниже - у бурят - 43/25 и у рус-

ских - 17/19.

2.4 Статистический анализ.

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с по-

мощью пакета компьютерных программ: Statistica 6, EpiInfo, «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях «случай–контроль», MDR, GMDR. О досто-

верности различий средних параметров судили по критерию Стьюдента, для не-

параметрических величин использовали критерий χ2 (в т.ч. с поправкой Йетса).

При анализе сравнений 2-х независимых выборок по одному признаку применяли

U-критерий Манна-Уитни. Для оценки взаимосвязи между исследуемыми показа-

телями использовали метод ранговой корреляции по Спирмену. Различия считали значимыми при р<0,05.

Для оценки соответствия распределения генотипов ДНК-маркеров ожидае-

мым значениям при равновесии Харди–Вайнберга (РХВ) и для сравнения распре-

делений частот аллелей и генотипов в выборках больных и здоровых использова-

ли критерий χ2. При несоответствии РХВ применяли точный критерий Фишера или χ2 с поправкой Йетса.

С целью определения факторов риска оценивали показатель отношения шан-

сов (ОШ), относительный риск (ОР) с оценкой 95% доверительного интервала

(95%ДИ). Значение ОШ, ОР=1 показывало отсутствие ассоциации; ОШ, ОР>1

рассматривали как положительную ассоциацию заболевания с признаком (фактор повышенного риска); ОШ, ОР<1 как отрицательную ассоциацию (фактор пони-

женного риска) [90, 104]. Отношение относительных рисков оценивалось при сравнении парных генотипов и респираторных симптомов по отношению к куре-

нию. Дополнительно оценивали атрибутивный риск (АР) и популяционный атри-

бутивный риск (ПАР).

Межгенные взаимодействия изучали двумя различными методами. Первый метод – сравнительный анализ парных комбинаций генотипов для оценки взаимо-

действия генов-кандидатов формирования БА между собой и с генами-

кандидатами предрасположенности к табакокурению между группами больных

78

БА и здоровых респондентов двух этнических принадлежностей (бурят и рус-

ских), и в группе курящих и некурящих подростков, больных БА. Вторым мето-

дом был анализ межгенных взаимодействий методом редукции мультифакторных пространств (MDR), в т.ч. с использованием ее модифицированной версии про-

граммы GMDR (Generalized Multifactor Dimentionality Reduction).

Автор выражает благодарность за консультативную помощь в математиче-

ской обработке результатов эксперту по статистике М.А. Подольной.

79

ГЛАВА 3. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У ПОДРОСТКОВ, ПРОЖИВАЮЩИХ В СЕЛЬСКОЙ МЕСТНОСТИ ЗАБАЙКАЛЬСКОГО КРАЯ

Бронхиальная астма является одним из наиболее распространенных хрони-

ческих заболеваний у детей. Официальные данные статистки основаны на обра-

щаемости в лечебно-профилактические учреждения и потому не могут соответ-

ствовать истинной распространенности аллергопатологии. Так, по данным обра-

щаемости, бронхиальная астма встречается менее чем у 1% детского населения, в

том числе в Забайкальском крае в 2005 г. – у 0,94%, в 2008 г. – у 0,96%, а по дан-

ным специальных исследований встречаемость бронхиальной астмы в Восточной Сибири колеблется от 3,1% до 9,5% [29, 30, 39, 51, 92, 112].

Первый этап обследования включал анкетный скрининг с использованием вопросника ISAAC в 2005 г.

В 2005 году распространенность симптомов затрудненного свистящего ды-

хания в течение жизни у подростков составила 15,6% - у бурят и 26,3% - у рус-

ских (Р<0,001) (табл. 10). В течение последних 12 месяцев эпизоды затрудненного свистящего дыхания отмечались 5% у бурят и у 9,6% русских (Р<0,001), при этом они не различались в зависимости от пола. Эпизоды свистящего хрипящего дыха-

ния с частотой от 1 до 3 раз за последние 12 мес отмечены у 4,1% бурят и у 7,4%

русских (Р<0,01); с частотой от 4 до 12 раз– соответственно у 0,9% и у 1,9% (р=0,056); с частотой более 12 раз только у 2 (0,4%) подростков русской этно-

группы. Частота расстройств сна в связи с приступами затрудненного хрипящего,

свистящего дыхания составила у бурят 1,3% и у русских 3,7% (Р<0,001). Тяжелые эпизоды затрудненного свистящего дыхания в течение последних 12 мес отмеча-

лись у бурятских школьников вчетверо реже 0,4% (Р<0,01), чем у русских – 1,7%.

Симптомы бронхоспазма при физической нагрузке отмечались также реже у бу-

рят 8,3% по сравнению с русскими (13,1%; Р=0,001) (табл. 10) [12].

Для второго этапа «ISAAC» были отобраны 130 подростков, у которых в анкете было отмечено наличие астмоподобных симптомов за последние 12 мес.

80

Таблица 10. Динамика симптомов бронхиальной астмы у подростков 12-18 лет в зависимости от национальности у подростков Забайкальского края [12]

Частота симптомов БА: (наличие затрудненного хрипящего свистящего дыхания, свистов в грудной клетке)

Ночные симптомы: (нарушение сна из-за затрудненного хрипящего свистящего дыхания)

Значимость различий χ2 * p<0,05, ** p<0,01, ***p<0,001 - между бурятами и русскими в 2005 году, #p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001 Р2 в 2008 году, Р3 между бурятами в 2005 и 2008 года, Р4 между русскими 2005 и 2008 г. Р5сравнение диагноза по анкете и после обследования в исследуемой популяции