диссертации / 17

221

эпителиальных клетках легкого и в свою очередь (через цАМФ) активируют протеинкиназу А.

β2-адренорецепторы активируют аденилатциклазу, что приводит к уве-

личению внутриклеточного уровня цАМФ. Взаимодействие β2-

адренорецептора с аденилатциклазой происходит через тримерный Gs белок,

состоящий из α-субъединиц (стимулирующие аденилатциклазу) и BG-

субъединиц (преобразующие другие сигналы). Механизм, посредством кото-

рого цАМФ вызывает релаксацию гладкомышечных клеток дыхательных пу-

тей до конца не изучен, но считается, что цАМФ катализирует активацию протеинкиназы A, которая фосфорилирует ключевые регуляторные белки,

участвующие в контроле мышечного тонуса. В большинстве случаев действие

β2-адренорецепторов опосредовано Gs белками и цАМФ-зависимую систему протеинкиназы А. Увеличение цАМФ приводит к торможению трансмем-

бранного транспорта ионов кальция и его выхода из внутриклеточных депо,

приводя к релаксации гладких мышц дыхательных путей. Существует также независимый механизм связывания β2-агонистов и Gs-белка с кальциевыми каналами, которые расположены в мембране гладко-мышечных клеток дыха-

тельных путей. β2-адренорецепторы могут также соединяться с Gi белком,

приводя к стимуляции внеклеточного сигнала регулирования киназы и р38

митоген-активированной протеинкиназы (МАРК). Активация МАРК пути β2-

адренорецепторами требует фосфорилирования рецептора протеинкиназой А опосредованно через BG-субъединицы белка, включая стимуляцию МАPК

при отсутствии рецептора тирозинкиназы. Этот механизм может расщепить

β2-рецептор с Gs и прекратить ответ рецептора на β2-агонист. Доказано, что β2-

адренорецепторная активация МАPК пути ведёт к фосфорилированию глюко-

кортикоидных рецепторов (GR), делая их более чувствительными к стероид– зависимой активации. Активация β2-адренорецептора также увеличивает транслокацию глюкокортикоидного рецептора из цитозоля клетки к ядру, яв-

ляясь фундаментальным моментом в механизме противовоспалительной ак-

тивности кортикостероидов. Это опосредовано активацией при CCAAT свя-

зывающего белка (С/EBPa) [232].

222

Высвобождение медиаторов бронхоконстрикции определяетсят соотно-

шением цАМФ/цГМФ в тучных клетках. цАМФ подавляет высвобождение гистамина и других медиаторов воспаления, в то время как цГМФ обладает обратным действием [238, 370]. У курящих выявлено носительство мутантно-

го (минорного) аллеля G (генотипов GG или CG) гена ADRB2 (Gln27Glu), кото-

рое приводит к понижению синтеза цАМФ. В результате чего меняется соот-

ношение цАМФ/цГМФ в тучных клетках в сторону цГМФ, что приводит к усилению выброса медиаторов аллергического воспаления (гистамина, нейро-

фильных протеаз, лейкотриенов В4, С4, Е4 D4, простогландинов D2, F2a,

тромбоксана А2, фактора активации тромбоцитов и интерлейкинов IL -3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 и ТNFα) и к бронхоконстрикции [370].

Холинергические рецепторы также ответственны за активацию гуа-

нилатциклазы, участвующей в синтезе цГМФ. Мускариновые рецепторы М2

переключают β2-адренорецепторы гладких мышц дыхательных путей, т.к. ак-

тивация М2 приводит к снижению накопления цАМФ в клетках. Преоблада-

ние холинергической системы над адренергической у больных БА потенциру-

ет проявления патохимической и патофизиологической фаз иммунологиче-

ских реакций, реализуясь соответствующими особенностями клинических проявлений [45, 80, 232].

Как известно, при курении выбрасывается в больших концентрациях дофамин, который также стимулирует α- и β-адренорецепторы. Влияние на адренорецепторы связано не столько с прямой их стимуляцией, сколько со способностью дофамина высвобождать норадреналин из гранулярных преси-

наптических депо, то есть оказывать непрямое адреномиметическое действие

[94]. Скорее всего β2-адренорецепторы, находящиеся в гладкомышечных клетках бронхов и сосудов, эпителиальных клетках воздухоносных путей,

опосредованно влияют на экспрессию генов NOS3 (VNTR). В норме оксид азота, синтезируемый eNOS, ведет к цГМФ-зависимой релаксации гладкой мускулатуры бронхов. Наличие минорного генотипа *4/4 увеличивает экс-

прессию гена NOS3 в эндотелии сосудов легких, приводит к подавлению син-

теза NO, нарушению активности фермента, снижению мукоцилиарного кли-

223

ренса и, как следствие, под действием ацетилхолина развивается брон-

хоконстрикция [324]. Под воздействием TNFα активируется экспрессия гена индуцибельной синтазы оксида азота (NOS2A), который усиливает аллергиче-

ское воспаление в бронхах[238].

Роль гена гасдермина в развитии БА также пока до конца не ясна. Поли-

морфный локус rs7216389 гена GSDMB расположен в последовательности,

высоко гомологичной провоспалительному транскрипционному фактору

C/EBPb, вовлеченному в регуляцию клеточного цикла - дифференцировку клеток, экспрессию генов цитокинов и апоптоз [293, 332]. Через активацию связывающего белка (С/EBPa) происходит активация β2-адренорецептора,

увеличение ядерной транслокации глюкокортикоидного рецептора [232].

Табачный дым вызывает активацию альвеолярных макрофагов, которые экспрессируют ген низкоафинного рецептора IgE (FCERII), в результате чего высвобождаются лейкотриены В4, С4, вазоактивные простагландины D2, F2,

тромбоксан А2, фактор активации тромбоцитов, интерлейкины (IL-1, IL-6, IL-

8), ТNFα, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Все эти веще-

ства усиливают дегрануляцию тучных клеток, нейтрофильное воспаление и оксидативный стресс [80].

Ассоциация минорного генотипа GG гена ADRB2 (Gln27Glu) у курящих больных может привести к подавлению β2-AР и снижению их плотности на поверхности лимфоцитов, а следовательно к снижению синтеза цАМФ и нарушению ответа на катехоламины [251]. У ежедневных курильщиков гомо-

зигот гена ADRB2 (Arg-16) установлен повышенный риск развития бронхи-

альной астмы ОШ=7,81 [2,07-29,5], по сравнению с некурящими. Риск заболе-

вания возрастал с увеличением показателя пачка/лет у гомозит (Arg-16), при пачка/лет=8 (р<0,05), пачка/лет=16 (р<0,01). В отношении полиморфизма

ADRB2 Gln27Glu значимых различий, ассоциированных с курением, не опре-

делено [383]. У неэкспонированных к табаку детей с Gln27 определялся более низкий уровень NO по сравнению с Gly16 гомозиготами (15,4 по сравнению

30,9 ppb) и Glu27 гомозиготами (18,0 по сравнению с 49,7 ppb) [409].

224

По данным проспективного исследования в течение 12 месяцев у детей пассивных курильщиков в домашних условиях с БА определена ассоциация

NOS3 с экспозицией никотина и уровнем FeNO. Среди лиц с аллелем Т и соче-

танием генотипов GT и ТТ гена NOS3 при повышении экспозиции никотина уровень FeNO снижался, тогда как у носителей гомозиготного генотипа GG

экспозиция никотина не влияла на уровень FeNO [350]. Уровень данного био-

маркера (FeNO) у курящих больных БА не увеличивался, что связано с ингиби-

рованием NO-синтазы под воздействием высоких концентраций экзогенного оксида азота и монооксида углерода, вдыхаемых с сигаретным дымом, либо ингибированием NO-синтазы, вызванным ростом бактерий [239].

Снижение ответа на противовоспалительное действие ИГКС является основным препятствием для эффективной борьбы с бронхиальной астмой у курильщиков, пациентов с тяжелой БА и у большинства пациентов с хрониче-

ской обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) [133]. У пациентов с тяжелой БА, можно выделить несколько молекулярных механизмов, которые объясня-

ют снижение ответа на ИГКС:

- уменьшение ядерной транслокации глюкокортикоидных рецепторов (GR) α

после связывания глюкокортикостероидов. Это объясняется модификацией

GR с помощью фосфорилирования в результате активации нескольких киназ

(р38 митоген-активированной протеинкиназы α, р38 митоген-активированной протеинкиназы γ и C-JunN-терминальной киназы 1). Они понижают актив-

ность фосфатаз (митоген-активированной протеинкиназы фосфатазы 1 и про-

теинфосфатазы A2);

-повышенная экспрессия GRβ, которые конкурируют с GRα и тем самым тормозят активировацию GRα;

-повышенная секреция фактора ингибирования миграции макрофагов, кото-

рый конкурирует с фактором транскрипции активатора протеина 1, и умень-

шает экспрессию гистон-деацетилазы (HDAC2). HDAC2 появляется в качестве посредника действия глюкокорткостероидов, чтобы выключить активирован-

ные воспалительные гены. Но у пациентов с ХОБЛ, пациентов с тяжелой бронхиальной астмой, и курильщиков, страдающих астмой, HDAC2 активи-

225

руются и экспрессируются окислительным стрессом через активацию фосфо-

инозитид-3-киназы δ [133];

-увеличение активации провоспалительных факторов транскрипции (ядерного фактор – kappa B), цитокинов (IL-2, -4, -8, TNF-α);

-неаллергическое воспаление дыхательных путей (снижение выработки эози-

нофилов, увеличение количества и активация нейтрофилов) [133, 196, 358, 369].

Стратегия управления стероидной резистентностью включает примене-

ние альтернативных противовоспалительных препаратов. Новый подход за-

ключается в обратном таковому при стероидной резистентности увеличении экспрессии HDAC2, которая достигается применением теофиллинов и фосфо-

инозитидного ингибитора 3-киназы δ. β2-агонисты длительного действия мо-

гут также увеличить ответ на стероиды путем фосфорилирования GRα [133]. В

другом исследовании курение сигарет у больных БА уменьшало терапевтиче-

ский ответ теофиллинов посредством индукции печеночных изоферментов цитохрома Р450 [149]. Определение молекулярных механизмов стероидной резистентности у больных с бронхиальной астмой и пациентов с ХОБЛ может указать путь к более эффективному противовоспалительному лечению [133].

У курящих риск формирования БА оказался выше по 8 сочетаниям пар-

ных генотипов (отношение относительных рисков =1,4-2,7). Для оценки доли вклада сочетанного воздействия генетических и средовых (табакокурения)

факторов рассчитан атрибутивный риск. Наибольшие значения атрибутивного риска отмечены для следующих пар двухлокусных сочетаний генотипов:

GSDMB rs7216389*TT - TNFA (-308G>A) *GG (АР=41,8%); GSDMB rs7216389*TT - NOS3 (VNTR)*5/5 (АР=35,7%); GSDMB rs7216389*TT -

CHRNA5 rs16969968*GG (АР=35,6%); GSDMB rs7216389*TT - THOI (STR)*SS

(АР=34,3%) и GSDMB rs7216389*TT - GSTM1 del*1/1 (АР=32,2%). Следует отметить, что во всех парных сочетаниях генотипов присутствует генотип rs7216389*TT гена GSDMB!

Исследование межгенных взаимодействий у курящих подростков пока-

зало три модели, предрасполагающих к развитию БА. Среди всех n-локусных

226

моделей наиболее значимыми оказались двухлокусная модель взаимодействия полиморфных генов GSDMB rs7216389 х NOS3 (VNTR), трехлокусная модель

GSDMB rs7216389 х ADRB (Gln27Glu) х NOS3 (VNTR) и четырехлокусная мо-

дель GSDMB rs7216389 х ADRB (Gln27Glu) х NOS3 (VNTR) х TH0I (STR) у ку-

рящих больных БА, о чем свидетельствует сочетание максимальных показате-

лей каждого критерия выбора.

Наибольший добавочный генетический атрибутивный риск у курящих в двухлокусной модели взаимодействия генов определен для генотипа GSDMB rs7216389*TT –– NOS3 (VNTR)*5/5 и составляет 35,7%; в трехлокусной моде-

ли: GSDMB rs7216389*TT – ADRB (Gln27Glu)*СG - NOS3 (VNTR)*5/5 - 19,8%;

в четырехлокусной модели: GSDMB rs7216389*TT – ADRB (Gln27Glu)*СG –

NOS2 (CCTTT)n*LL - TH0I (STR)*SS - 12,3%.

Выявлено 4 значимых модели взаимодействий у некурящих больных БА: двухлокусная модель GSDMB rs7216389 х CHRNA5 rs16969968; трехло-

кусная модель GSDMB rs7216389 х ADRB (Arg16Gly) x ADRB (Gln27Glu); че-

тырехлокусная модель GSDMB rs7216389 х ADRB (Arg16Gly) x ADRB

(Gln27Glu) x CHRNA5 rs16969968 и пятилокусная GSDMB rs2305480 x GSDMB rs7216389 х ADRB (Arg16Gly) х ADRB (Gln27Glu) x CHRNA5 rs16969968.

Анализ межгенных взаимодействий позволил установить сложный характер взаимодействий между генами-кандидатами развития БА и генами-

кандидатами предрасположенности к табакокурению и возможные патогенетические различия воздействия внешне-средового фактора риска

(табакококурения), а также позволил рассчитать дополнительный вклад табакокурения в развитие БА (генетический аттрибутивный риск).

Направления реабилитации подростков с бронхиальной астмой. С

учётом доказанного вклада табакокурения в формирование и более тяжелое течение бронхиальной астмы, видится важным включение антисмокинговых программ в комплекс реабилитационных мероприятий для подростков с БА.

Обоснование направленности антитабачных программ у курящих под-

ростков. Ранее нами показано, что среди ежедневных активных курильщиков установлена очень слабая (у 73,3%) и слабая (у 18,9%) никотиновая зависи-

227

мость у бурят; соответственно 48,2% и 31,2%, - у русских. У курящих под-

ростков выявлен целый ряд соответствующих психологических особенностей.

Полученные данные обусловливают необходимость сосредоточения, в

первую очередь, на психологических и педагогических проблемах борьбы с табакокурением у подростков, поскольку никотиновая зависимость как тако-

вая не превалирует и лишь у небольшой части курящих подростков (в среднем у 12,6%, а среди больных БА – у 30%) необходима лекарственная поддержка.

Т.о., антитабачные программы должны быть направлены, в первую очередь,

на воспитание здорового образа жизни, а у курящих подростков - на снижение интенсивности курения и усиление мотивации бросить курить. На эти же ас-

пекты в борьбе с табакокурением делает упор Машукова Н.Г., Геппе Н.А., Чу-

чалин А.Г. и ряд других исследователей [59, 109, 110].

Затяжной кашель и физикальные изменения в легких у детей при обострении БА на фоне ОРИ у курящих подростков, явились основанием для включения в комплекс терапии наряду с противоастматическими мукорегули-

рующих средств, помогающих быстрее купировать указанные симптомы. В

качестве оптимального мукорегулирующего препарата у курящих подростков с БА нами выбран препарат лизиновой соли карбоцистеина (ЛКЦ) –

Флуифорт, применение которого в данной ситуации патогенетически наибо-

лее обосновано. У курящих подростков на фоне приема ЛКЦ сухой кашель быстрее, чем у некурящих, переходил во влажный, который, правда, как и влажные хрипы в легких, сохранялся у курящих подростков несколько дли-

тельнее, чем у некурящих (соответственно 7,73±0,70 дн. против 5,33±0,69 дн.;

р<0,05, и 2,64±0,53 дн. против 1,33±0,61 дн.; р<0,05). Несмотря на большую выраженность физикальных изменений в легких и продуцирования мокроты у курящих подростков, применение ЛКЦ позволило эффективно купировать эти симптомы. В динамике (перед лечением и на 21 день от начала лечения)

определяли уровень sIgA. В динамике заболевания ЛКЦ предупреждало сни-

жение уровня sIgA у курящих подростков и значимо повышало у некурящих.

Соответственно прирост sIgA (∆sIgA) составил -1,9±1,4 и 7,5±2,1 мкг/мл

(р<0,01).

228

Полученные данные свидетельствуют о клинико-иммунологической эффективности ЛКЦ у подростков с бронхиальной астмой на фоне ОРВИ и формирующимся хроническим бронхитом курильщика [67, 70, 71, 73, 75].

Усилению эффекта противовоспалительной базисной терапии у подростков с бронхиальной астмой может способствовать применение в комплексной реабилитации босвеллиевых кислот. Наши наблюдения показали, что заболеваемость ОРИ и частота приступов затруднения дыхания в период курса реабилитации в группе подростков, получавших Бронходиол и Плацебо, достоверно не различались, однако на фоне Бронходиола отмечено достоверное повышение толерантности к физической нагрузке (р<0,05).

На фоне терапии Бронходиолом у подростков с БА удалось добиться более выраженного улучшения контроля над заболеванием (р<0,001) через 3

месяца в сравнении с Плацебо (р<0,01).

Через 3 месяца после проведенного курса Бронходиола у подростков достоверно увеличились показатели функции внешнего дыхания – ЖЕЛ,

ФЖЕЛ, ОФВ1, ПСВ, и проходимость по крупным (МОС25), средним

(МОС50) и мелким (МОС75) бронхам (p<0,05 - p<0,001).

Прирост уровня sIgA в слюне у детей с бронхиальной астмой после курса Бронходиола на 21 день был достоверно выше в сравнении с контрольной группой (Плацебо) (р 0,05), что может результировать повышением устойчивости к вирусным инфекциям, являющимся важнейшими триггерами обострений бронхиальной астмы.

Исследование цитокинов в сыворотке крови у больных с БА показало,

что через 3 месяца на фоне приёма Бронходиола или Плацебо у подростков уровни IL-8 снижались в обеих группах (р 0,05). В то же время уровень про-

тивовоспалительного цитокина IL-4 через 3 месяца увеличивался вдвое только у детей, получавших Бронходиол (р 0,01), в связи с чем только в этой группе имело место увеличение соотношения IL-4/IL-8 (р 0,05).

Полученные нами результаты совпадают с данными Буркастовой Л.Н.,

Gupta I. и других исследователей, доказавших клинико-иммунологическую

229

эффективность бронходиола у детей и взрослых с БА, проявлявшуюся в повышении толерантности к физической нагрузке, облегчении течения заболевания, нормализации показателей функции внешнего дыхания,

положительном влиянии на местный иммунитет, снижении уровня IL-8 и

повышении содержания IL-4 [32, 33, 202].

В связи с этим БАД «Бронходиол» может быть использована в комплексах лечебно-реабилитационных мероприятий у подростков с нетяжелой бронхиальной астмой, как природное противовоспалительное средство на основе растительных антилейкотриенов. И, конечно, её применение тем более оправдано у курящих подростков с БА.

Таким образом, полученные нами результаты комплексного исследова-

ния подростков с бронхиальной астмой, проживающих в сельской местности АБО Забайкальского края позволили оценить распространенность данной па-

тологии, охарактеризовать динамику распространенности астмоподобных симптомов и заболеваемости бронхиальной астмой по международной про-

грамме ISAAC. Оценен вклад активного табакокурения в развитие БА, его влияния на течение заболевания. Исследованы полиморфные варианты целого ряда генов-кандидатов бронхиальной астмы (FCER2, ADRB2, TNFA, GSTM1, NOS2, NOS3 и GSDMB) и генов-кандидатов предрасположенности к табакоку-

рению (THOI и CHRNA5), межгенные и ген-средовые взаимодействия (вклад табакокурения). Последнее дало возможность установить генетические фак-

торы риска развития этой патологии и раскрыть некоторые ранее неизвестные патогенетические аспекты данного заболевания у представителей разных эт-

носов.

Учитывая повышение общего IgE у коренного населения в динамике у больных БА, и отсутствие ассоциации формирования заболевания с геном

FCER2 видится перспективным дальнейшие исследования ассоциаций с гена-

ми FCER1, геном ИЛ13 и ИЛ4, отвечающими за выработку общего IgЕ у ато-

пиков из числа коренного населения. А также дальнейшее исследование ассо-

циаций генов-кандидатов с тяжелым течением заболевания у лиц, в том числе имеющих в анамнезе астматический статус, другими внешне-средовыми фак-

230

торами риска развития астмы, поиск других генов-кандидатов БА методикой

GWAS в субпопуляции агинских бурят. Определение молекулярных механиз-

мов стероидной резистентности у больных с астмой и пациентов с ХОБЛ мо-

жет привести к разработке более эффективных схем противовоспалительной терапии.