vse_metody_MIKROB

Занятие №1

Тема. Структура бактериологической лаборатории и правила работы в ней. Основные методы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. Морфология бактерий, плесневых и дрожжеподобных грибов.

Цель занятия. Ознакомиться с порядком работы иммерсионной системы светового микроскопа и освоить технику микроскопии готовых окрашенных препаратов. Изучить морфологию бактерий и микроскопических грибов.

I.Теоретические знания

1.История кафедры микробиологии и вирусологии №1 РостГМУ.

2.Структура бактериологической лаборатории.

3.Основные методы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

4.Систематика и номенклатура микробов.

5.Размеры и основные формы бактерий.

6.Морфология плесневых и дрожжеподобных грибов.

II.Практические навыки

1.Соблюдение правил противоэпидемического режима и техники безопасности

вбактериологических лабораториях.

2.Работа с иммерсионной системой светового микроскопа. Световая микроскопия препаратов чистых культур бактерий шаровидной, палочковидной и извитой форм, дрожжеподобных грибов рода Candida, а также нативных препаратов гнойного отделяемого и крови.

1

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1. История кафедры микробиологии и вирусологии.

Кафедра микробиологии была организована в 1916 г. на базе медицинского факультета Варшавского университета. Первым руководителем кафедры был профессор Владимир Александрович Барыкин (1916-1921 гг.), который внес большой вклад в изучение этиологии, патогенеза и диагностики сыпного тифа.

В этот период на кафедре работали помощник прозектора П.Ф. Здродов-

ский (в дальнейшем д.м.н., профессор, академик АМН СССР) и З.В. Ермольева

(в дальнейшем д.м.н., профессор, академик АМН СССР, лауреат Государствен-

ной премии за создание отечественного пенициллина и успешное его примене-

ние в годы Великой Отечественной войны).

В последующие годы (1922-1926 гг.) научными проблемами кафедры яв-

лялись вопросы профилактики и лечения дифтерии, изучения биологии холер-

ных вибрионов и этиологии чумы. В 1926-1930 гг. кафедрой заведовал д.м.н.,

профессор Михаил Иванович Штуцер, внесший большой вклад в изучение туберкулеза на Северном Кавказе и проведение профилактических прививок среди населения. В годы работы проф. М.И Штуцера сотрудники кафедры за-

нимались изучением проблем внутривидовой изменчивости микробов. Был изучен диссоциативный процесс у брюшнотифозных, паратифозных, кишечных палочек, протея и других бактерий. Эти исследования позволили выявить пол-

ноценные варианты бактерий для приготовления убитых вакцин против кишеч-

ных инфекций. Были изучены и систематизированы представления о возбуди-

телях бактериальной дизентерии (один из видов назван «Шигелла Штуцера-

Шмитца»).

С 1930 г. по 1938 г. кафедрой заведовал д.м.н., профессор Александр Александрович Миллер. В эти годы кафедра стала центром методологической работы в области микробиологии и эпидемиологии. Сотрудники кафедры ак-

тивно участвовали в борьбе с эпидемиями и оказывали помощь бактериологи-

ческим лабораториям. Профессор А.А. Миллер занимался вопросами профи-

2

лактики туляремии, диагностики дизентерии, изучения микрофлоры водных источников и пищевых продуктов. Было издано единственное в то время руко-

водство по санитарной микробиологии. А.А. Миллер имел много учеников и создал школу высокопрофессиональных микробиологов.

В 1945-1948 гг. кафедрой заведовал профессор Борис Яковлевич Эль-

берт, лауреат Государственной премии, заслуженный деятель науки, внесший большой вклад в изучение проблемы патологии и природной очаговости туля-

ремии в Ростовской области. Итогом этой работы явилось создание отечествен-

ного препарата для профилактики туляремии – живой вакцины Эльберта-

Гайского.

Также кафедрой заведовали известные микробиологи и организаторы здравоохранения: к.м.н., доцент Наталья Дмитриевна Криницкая (1938-1940

гг., 1943-1945 гг., 1948-1950 гг.), д.м.н., профессор Анна Александровна Ка-

шаева (1950-1963 гг.). Ведущим научным направлением кафедры в этот период было изучение изменчивости энтеробактерий. Затем, с 1964 по 1965 гг. заве-

дующим кафедрой был профессор Моисей Иосифович Леви, талантливый ис-

следователь, имевший многочисленные работы по вирусологии, иммунологии и серологии. На кафедре работала д.м.н., профессор Екатерина Петровна Моска-

ленко, внесшая большой вклад в изучение этиологии, патогенеза, диагностики,

профилактики коклюша и дифтерии.

С 1966 г. по 1991 г. кафедру возглавлял д.б.н., профессор Александр Ефимович Эссель. Научная работа кафедры приобрела выраженное вирусоло-

гическое направление. Основной проблемой, изучаемой сотрудниками кафед-

ры, стали вирусобактериальные ассоциации, в том числе, экспериментальные исследования по изучению ассоциаций кишечных, дизентерийных и брюшно-

тифозных бактерий с кишечными неполиомиелитными вирусами, а также ассо-

циаций стафилококков с аденовирусами. Итогом исследования в этом направ-

лении стала, выпущенная в 1978 г., первая в России монография «Вирусобакте-

риальные ассоциации», предисловие к которой написано ведущим вирусологом страны, академиком АМН СССР В.М. Ждановым. А.Е. Эссель создал одну из

3

лучших в России школ микробиологов. Александр Ефимович был необыкновенно талантливым и неординарным ученым и педагогом, великолепным лектором.

Его лекции помнят многие поколения студентов. Его отличали не только высокие профессиональные качества, неукротимая энергия и фанатичная преданность своей специальности, но и истинная интеллигентность, душевная щедрость, любовь к искусству, и поэтому он всегда был окружен своими учениками. А.Е. Эссель отличался большой эрудицией и лингвистическими способностями, владел рядом европейских языков. Коллектив кафедры и в настоящее время продолжает славные традиции чтения лекций и преподавания дисциплины, заложенные А.Е. Эсселем.

С 1991 г. по 2016 г. кафедру возглавляла д.м.н., профессор Лариса Ива-

новна Васильева, внесшая большой вклад в изучение микробиоценозов новорожденных в условиях нормы и септической патологии. Впервые доказана важная роль неспорообразующих анаэробных бактерий в формировании сепсиса у новорожденных, что позволило увеличить эффективность микробиологической диагностики этой патологии.

С 2016 г. кафедру возглавила д.м.н., профессор Набока Юлия Лазаревна,

основным направлением научной деятельности является изучение микробиоты урогенитального тракта в норме и при различной патологии. Впервые доказана роль некслотридиальных анаэробных бактерий в развитии острого обструктивного пиелонефрита. Впервые дана характеристика микст-инфекции секрета предстательной железы при хроническом бактериальном простатите. Показана взаимосвязь тяжести клинических проявлений хронического бактериального простатита с особенностями микробного спектра секрета предстательной железы. Изучена обсемененность миоматозного узла и неизмененного миометрия различными таксонами микроорганизмов пациенток с миомой матки.

Сотрудниками кафедры микробиологии и вирусологии №1 в настоящее время являются также профессор, д.м.н. Л.И. Васильева, к.м.н. М.Л. Черницкая,

4

доцент, к.м.н. И.А. Гудима, ассистент, к.м.н. Е.В. Митусова, ассистенты Н.Н.

Белоглазова, К.Т. Джалагония, И.Н. Леус, В.В. Крицкая.

2. Структура бактериологической лаборатории.

Структура бактериологической лаборатории включает собственно лабора-

торию и дополнительные помещения: для приготовления питательных сред,

для стерилизации (автоклавная), для мытья лабораторной посуды и др.

В собственно лаборатории находятся: термостат, холодильник, лаборатор-

ная мебель и др. На рабочем столе с хорошо освещенной поверхностью поме-

щают микроскоп, бактериологическую петлю, набор красителей, чистые пред-

метные стекла, спиртовку, штатив для пробирок, а также дезинфицирующий раствор для отработанного материала и пипеток и дезинфицирующий раствор для обработки рук.

Правила работы в бактериологических лабораториях кафедры мик-

робиологии и вирусологии №1.

Основная задача: предотвращение внутрилабораторных заражений со-

трудников и внутрилабораторной контаминации (загрязнения посторонними микробами) материала от больного во время микробиологического исследова-

ния, предупреждение распространения инфекций за пределы лаборатории.

Работу в бактериологической лаборатории проводят с инфицированным материалом, что требует тщательности, осторожности и соблюдения правил личной и общественной безопасности при ее выполнении.

Во избежание распространения инфекции работа обязательно проводится в халатах, шапочках, сменной обуви, без украшений на руках. Рукава халата должны прикрывать одежду, волосы следует полностью закрывать шапочкой. В

помещении лаборатории необходимо соблюдать чистоту и порядок: на рабочем столе не должно быть посторонних предметов. В лаборатории запрещен прием пищи. Во время работы не разговаривать и не ходить по лаборатории.

5

Все предметы, которые были использованы при работе с микроорганизма-

ми (петли, пипетки, предметные стекла, питательные среды и др.), должны быть сразу же обеззаражены, либо переданы для автоклавирования.

Если разбита лабораторная посуда или разлит заразный материал, об этом надлежит немедленно сообщить преподавателю и провести обеззараживающие мероприятия.

Вконце работы необходимо:

-сдать весь материал;

-привести в порядок рабочее место;

-обработать руки дезинфицирующим раствором и вымыть с мылом.

3.Основные методы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД в зависимости от объекта исследова-

ния подразделяют:

бактериоскопический метод используют для диагностики первичного сифилиса, острой мужской гонореи, туберкулеза, лепры, возвратного тифа;

вирусоскопический метод – обнаружение вирусов в исследуемом мате-

риале с помощью электронного микроскопа. При использовании светового микроскопа в материале от больного можно выявить характерные внутрикле-

точные включения, которые образуются в пораженных клетках при некоторых вирусных инфекциях. Диагностическое значение имеет обнаружение включе-

ний Бабеша-Негри при бешенстве, обнаружение гигантских клеток с внутри-

ядерными включениями при цитомегаловирусной инфекции. Такие клетки на-

поминают «совиный глаз».

6

Включениями при цитомегаловирусной инфекции («совиный глаз»)

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД в зависимости от объекта иссле-

дования подразделяют:

бактериологический метод – посев материала от больного с подозрение на бактериальную инфекцию на искусственные питательные среды с целью об-

наружения и идентификации возбудителя. Этот метод используют для диагно-

стики холеры, брюшного тифа, дизентерии, туберкулеза и др.;

вирусологический метод – заражение материалом от больного с подозре-

нием на вирусную инфекцию куриного эмбриона (для диагностики гриппа),

культур клеток (для диагностики аденовирусной инфекции, полиомиелита), ла-

бораторного животного (для диагностики клещевого энцефалита, бешенства).

Затем проводят идентификацию вируса;

микологический метод – посев материала от больного с подозрением на грибковую инфекцию на соответствующие питательные среды с последующей идентификацией плесневых и дрожжеподобных грибов.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД (от лат. serum – сыворотка и logos – уче-

ние) – определение в сыворотке крови больного антител к конкретному возбу-

дителю инфекционного заболевания. Используют для диагностики бруцеллеза,

туляремии, ВИЧ-инфекции др.

7

АЛЛЕРГОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД – определение состояния повышен-

ной чувствительности (аллергии) макроорганизма к микробным аллергенам.

Для диагностики инфекционных заболеваний используют следующие кожно-аллергические пробы:

-при туберкулезе – проба Манту с туберкулином;

-при бруцеллезе – проба Бюрне с бруцеллином;

-при туляремии – проба с тулярином;

-при сибирской язве – проба с антраксином.

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ:

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). С помощью ПЦР в исследуемом материале определяют не сам микроорганизм, а специфический участок его нуклеиновой кислоты (НК). Этот фрагмент становится матрицей для много-

кратного увеличения его копий (амплификация), что впоследствии дает воз-

можность визуально учесть реакцию. Для проведения ПЦР необходимы ДНК-

полимераза или РНК-полимераза и специфический праймер. Праймеры – это синтетические олигонуклеотиды, комплементарные фрагменту НК определяе-

мого микроорганизма. ПЦР – чрезвычайно чувствительный метод, т.к. позволя-

ет обнаружить небольшое количество микробной НК в исследуемом материале.

В настоящее время этот метод широко применяется для диагностики ВИЧ-

инфекции, вирусных гепатитов, хламидийной инфекции и др.;

Метагеномные исследования. Метагеномика – изучает генетический материал (метагеном) сообществ микроорганизмов в совокупности. Цель мета-

геномики – получение и анализ всех геномов для установления видового соста-

ва и метаболических взаимосвязей в микробном сообществе. Определение ви-

дового состава основанного на анализе нуклеотидных последовательностей хромосомных генов, кодирующих 16S p РНК. Эта РНК входит в состав мень-

шей субъединицы бактериальной рибосомы, а гены, которые ее кодируют,

практически не подвергаются изменениям в ходе эволюции (т.е. являются в вы-

8

сокой степени консервативными). Такой метод генетической идентификации позволяет определить фенотипическую принадлежность микроорганизмов, яв-

ляется основой геносистематики и позволяет определить степень родства орга-

низмов. В настоящее время метод широко используется как для изучения мик-

робных сообществ, населяющих человеческий организм (микробиом), так и для диагностики различных видов патологии.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД – обнаружение возбудителя путем зараже-

ния материалом от больного лабораторных животных. Используют для диагно-

стики ботулизма, бешенства. Кроме того, этот метод применяют для создания экспериментальных моделей инфекционных заболеваний.

4.Систематика и номенклатура микробов.

Вбиологической классификации живых организмов, в том числе микро-

бов, самый верхний (крупный) уровень группировки организмов в системе – это домен. Он включает в себя одно или несколько царств. Все царства объеди-

нены в четыре домена: бактерии, археи, вирусы и эукариоты. К домену «Bacteria» относят царство бактерий, к домену «Archaea» - царство архебактерий (са-

мые древние, примитивные бактерии), к домену «Vira» - царство вирусов. По-

следний домен «Eucarya» (эукариоты) включает царство Protozoa (простейшие)

и Eumycota (грибы).

ДОМЕНЫ:

I. Bacteria (царство бактерий);

II. Archaea (царство архебактерий);

III. Vira (царство вирусов);

IV. Eucarya (царство простейших и грибов).

Микроорганизмы (бактерии, вирусы, грибы, одноклеточные простейшие)

систематизированы по их сходству, различиям и взаимоотношениям между со-

9

бой. В основе систематики лежит филогенетический принцип, основанный на генотипических, а, следовательно, и фенотипических различиях, сформировав-

шихся в процессе эволюции. Систематика включает три части: классификацию,

таксономию (расположение, порядок) и идентификацию. Основой идентифика-

ции микроорганизмов являются их морфологические, физиологические, биохи-

мические, молекулярно-биологические и генотипические свойства. Все это по-

зволяет разделять существующие царства на типы, классы, порядки, семейства,

роды и виды.

5. Размеры и основные формы бактерий.

По размеру бактерии подразделяют:

мелкие (1-3 мкм);

средние (3-6 мкм);

крупные (> 6 мкм).

Основные формы бактерий:

1.Шаровидные – кокки.

2.Палочковидные.

3.Извитые.

КОККИ (в зависимости от взаиморасположения в мазке кокки подразде-

ляют):

микрококки (от греч. micros – малый) – в мазке располагаются одиночно;

диплококки (от греч. diplos – двойной) – в мазке располагаются попарно.

Диплококки могут быть:

- бобовидной формы:

Neisseria gonorrhoeae – возбудитель гонореи;

10