vse_metody_MIKROB

комбинантных бактерий, обладающих некоторыми свойствами донорских кле-

ток (рисунок 10).

Рисунок 10 – Трансформация у бактерий (схема)

Впервые феномен трансформации был установлен Ф. Гриффитсом в

1928 г. на модели бескапсульного и капсульного пневмококков (рисунок 11).

Следует напомнить, что капсула пневмококков – мощный фактор патогенности,

способствующий возникновению септического течения инфекции и гибели ла-

бораторного животного. Для проведения опыта в качестве индикатора исполь-

зовали 3 белые мыши. Первую мышь заражали живыми, бескапсульными неви-

рулентными пневмококками. Второй мыши вводили убитую культуру капсуль-

ных вирулентных пневмококков; третьей мыши – смесь живых бескапсульных пневмококков и убитых капсульных пневмококков.

В результате из всех мышей, взятых в опыт, погибала третья мышь, т.к.

живые бескапсульные пневмококки поглощали фрагменты ДНК убитых кап-

сульных, приобретали ген, кодирующий синтез капсулы, превращались в виру-

лентные пневмококки и убивали мышь.

10

Рисунок 11 – Опыт Ф. Гриффитса по трансформации пневмококков

Конъюгация у бактерий – передача генетического (хромосомного и не-

хромосомного) материала от бактерии-донора к бактерии-реципиенту при их непосредственном контакте (рисунок 12). Необходимым условием для конъю-

гации является наличие у бактерии-донора F-плазмиды, которая контролирует синтез половых pili на поверхности клеток-доноров.

Рисунок 12 – Конъюгация у бактерий (а – электронная микроскопия, б – схема)

Процесс конъюгации между бактерией-донором (F+) и бактерией-

реципиентом (F-) имеет следующие стадии:

установление контакта между донором и реципиентом с помощью половых

pili;

11

прохождение генетического материала через канал половой pili от донора к реципиенту;

рекомбинация между донорской и реципиентной ДНК.

F-плазмида может находиться как в автономном состоянии в цитоплазме,

так и в интегрированном с хромосомой клетки. Находясь в автономном состоя-

нии, она контролирует только собственный перенос при конъюгации. В резуль-

тате F- клетка превращается в F+ клетку, содержащую F-плазмиду. Если F-

плазмида интегрирована с хромосомой бактерии, то при конъюгации она кон-

тролирует не только собственный перенос, но и перенос части хромосомной ДНК в клетку-реципиент. С помощью интегрированной F-плазмиды частота переноса хромосомных генов между бактериями существенно возрастает.

Трансдукция и фаговая (лизогенная конверсия) у бактерий.

Трансдукция – перенос небольшого фрагмента хромосомной ДНК от клетки-донора к клетке-реципиенту с помощью умеренного бактериофага (ри-

сунок 13). В результате трансдукции бактерия-реципиент приобретает новые фенотипические признаки (ферментативные свойства, устойчивость к антибио-

тикам и др.). При выходе бактериофага из клетки фрагмент донорской трансду-

цированной ДНК остается в хромосоме клетки-реципиента, следовательно, со-

храняются и новые фенотипические признаки. Таким образом, при трансдукции умеренный бактериофаг выполняет только транспортную функцию.

Рисунок 13 – Трансдукция у бактерий

12

Фаговая конверсия (от лат conversion – превращение) – получение бакте-

рией новых свойств в результате использования генов профага, интегрирован-

ного с хромосомой клетки. Например, ДНК умеренного дифтерийного фага со-

держит ген tox, который кодирует синтез дифтерийного экзотоксина. Если ДНК такого умеренного фага интегрирует с ДНК дифтерийной палочки, то она пре-

вращается в токсигенную, т.е. продуцирующую дифтерийный экзотоксин. При выходе из клетки умеренного фага дифтерийные бактерии утрачивают ген tox и

теряют способность к продукции экзотоксина. Лизогенная конверсия выявлена также у возбудителей ботулизма, холеры и др.

Использование генной инженерии в медицине

Получение живых вакцин. В основе лежит принцип аттенуации, предложен-

ный Л. Пастером. Аттенуация – ослабление вирулентности микробов под действием физических, химических или биологических факторов с сохране-

нием их иммуногенных свойств. Например, вакцинный штамм туберкулез-

ных бактерий (БЦЖ) был получен А.Ш. Кальметом и Ж-М.К. Жереном пу-

тем длительного (13 лет) выращивания возбудителя туберкулеза на пита-

тельной среде с желчью.

Получение генно-инженерных вакцин (рекомбинантная дрожжевая вакцина против вирусного гепатита В из протективного HBs-антигена вируса).

Разработка и внедрение в практику молекулярно-биологических методов ди-

агностики инфекционных заболеваний, например, ПЦР.

Получение штаммов бактерий и микроскопических грибов с высокой про-

дукцией антибиотиков.

Получение инсулина, гормонов, интерферона и других биологических ве-

ществ в бактериальных клетках с помощью генно-инженерных методов.

13

5. Антибиотики. Классификация антибиотиков по механизму антимикроб-

ного действия.

Антибиотики – это химические вещества биологического происхождения,

а также их полусинтетические и синтетические аналоги, обладающие бактерио-

статическим или бактерицидным действием.

Антибиотики, обладающие бактериостатическим действием, подавляют рост и размножение микроорганизмов. Антибиотики, обладающие бактери-

цидным действием, вызывают гибель микроорганизмов.

Антибиотики были открыты английским ученым А. Флемингом и амери-

канским ученым С. Ваксманом. В 1929 г. А. Флеминг установил, что фильтрат бульонной культуры плесневого гриба Penicillium notatum содержит вещество

(пенициллин), угнетающее рост стафилококков. Однако, в чистом виде препа-

рат был получен лишь в 1940 г., после чего было налажено его промышленное производство. С. Ваксман открыл в 1944 г. стрептомицин (его продуцентом яв-

ляется Actinomyces griseus) и предложил впервые термин «антибиотик» (от греч. anti, bios – против жизни). В настоящее время существует более 6 тысяч природных антибиотиков и созданы многие десятки тысяч полусинтетических и синтетических препаратов.

14

Антибиотики могут вырабатывать клетки животного (лизоцим) и расти-

тельного происхождения (фитонциды чеснока и лука), однако широкого произ-

водственного применения в медицине они не имеют.

Основными источниками получения природных и полусинтетических

антибиотиков являются:

-плесневые грибы родов Penicillium и Cephalosporium – синтезируют бета-

лактамные антибиотики (пенициллины и цефалоспорины);

-актиномицеты (ветвящиеся бактерии) – синтезируют большинство (80%)

природных антибиотиков, в том числе стрептомицин, ванкомицин, нистатин и др.;

-бактерии (бациллы, псевдомонады и др.).

Группы антибиотиков по химической структуре:

бета-лактамные (пенициллины, цефалоспорины, монобактамы, карбапенемы);

макролиды;

производные диоксиаминофенилпропана (левомицетин);

тетрациклины;

аминогликозиды;

спектиномицин;

полимиксины;

гликопептиды;

липопептиды;

ансамицины (рифампицин);

полиеновые антибиотики;

антибиотики других химических групп.

15

Синтетические противомикробные химиотерапевтические препараты.

Методами химического синтеза созданы вещества, которые не встречаются в живой природе, но похожи на антибиотики по механизму и спектру действия.

К наиболее значимым группам относят:

1.сульфаниламиды (производные сульфаниловой кислоты);

2.хинолоны;

3.нитрофураны;

4.8-оксихинолины;

5.производные хиноксалина;

6.5-нитроимидазолы

7.оксазолидиноны.

В бактериальной клетке есть четыре основные области, которые отличают-

ся от клеток человека и определяют клиническую эффективность действия ан-

тибактериальных препаратов: клеточная стенка, рибосомы, нуклеиновые

кислоты и цитоплазматическая мембрана.

По механизму действия антибиотики подразделяют:

1. Бактерицидные:

нарушают синтез клеточной стенки или ее компонентов (бетa-лактамы,

фосфомицин, ристомицин);

нарушают морфо-функциональную организацию цитоплазматической мембраны (полимиксины, полиены);

нарушают репликацию ДНК (фторхинолоны).

2. Бактериостатические:

ингибируют синтез белка на уровне РНК-полимеразы (рифампицины);

ингибируют синтез белка на уровне рибосом (тетрациклины, левомице-

тин, фузидин, макролиды и др.).

16

Антибиотики могут быть узкого спектра (действуют только на грамотри-

цательные бактерии или на некоторые виды грамположительных бактерий), а

также широкого спектра (действуют на грамположительные и грамотрица-

тельные бактерии).

Существуют специальные группы антибиотиков: противотуберкулез-

ные, противогрибковые и др.

Нерациональное применение антимикробных лекарственных средств для лечения инфекционных заболеваний нередко приводит к формированию лекар-

ственной устойчивости – антибиотикорезистентности. Бактерии следует счи-

тать резистентными, если они не обезвреживаются оптимальными терапевтиче-

скими дозами препарата, вводимого в организм. Резистентность может быть

природной и приобретенной. Приобретенная лекарственная резистентность связана с адаптацией микроорганизмов к условиям окружающей среды. Про-

блема формирования и распространения лекарственной резистентности микро-

бов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых госпи-

тальными микробами с множественной лекарственной устойчивостью к не-

скольким антибиотикам (так называемая полирезистентность).

6.Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

Осложнения и последствия антибиотикотерапии.

Метод серийных разведений. В пробирках готовят двукратные разведе-

ния антибиотиков, а затем к каждому разведению добавляют взвесь исследуе-

мых бактерий. После термостатирования в течение суток при 370С определяют минимальную подавляющую концентрацию антибиотика (МПК), т.е самую низкую концентрацию препарата, которая полностью задерживает рост бакте-

рий (рисунок 14).

17

Рисунок 14 – Определение чувствительности бактерий к антибиотикам ме-

тодом серийных разведений

Диско-диффузионный метод. Производят посев выделенной от больно-

го культуры бактерий сплошным газоном на пластинчатый МПА. Затем на по-

сев помещают стандартные бумажные диски, пропитанные различными анти-

биотиками, и термостатируют при 370С 24 часа.

Учет результатов проводят по диаметру зон отсутствия роста бактерий во-

круг дисков (рисунок 15). Размеры зон подавления роста сравнивают со стан-

дартами и определяют антибиотик, который необходим для лечения.

Рисунок 15 – Определение чувствительности бактерий к антибиотикам диско-диффузионным методом

18

Осложнения и последствия антибиотикотерапии

Аллергические реакции (крапивница, анафилактический шок и др.). Могут вы-

зывать большинство антибиотиков.

Иммунотоксическое действие на клеточный и гуморальный иммунитет, а так-

же фагоцитоз (тетрациклины, левомицетин и др.).

Токсические реакции в связи с органотропным действием антибиотиков при длительном лечении: поражение печени (тетрациклин, рифампицин), почек

(стрептомицин, полимиксин), костного мозга (левомицетин) и др.

Эндотоксический шок. Развивается в тех случаях, когда под влиянием анти-

биотика происходит массовое разрушение грамотрицательных бактерий и по-

ступление в кровь их эндотоксинов.

Дисбактериозы. Развиваются после длительного применения антибиотиков,

подавляющих резидентную микрофлору организма.

Формирование антибиотикоустойчивых микробов.

Практическая работа

1. Определение фаготипа бактерий.

Провести фаготипирование культур микроорганизмов, выделенных от больного и предполагаемого источника инфекции для выявления эпидемиоло-

гической цепочки при вспышке инфекционного заболевания. Учет фаготипиро-

вания культур S.typhi, выделенных от больных брюшным тифом и брюшноти-

фозного носителя по демонстрации.

2. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам.

Метод серийных разведений.

I этап исследования. Приготовить двукратные разведения антибиотика

(гентамицин) в МПБ в объеме 2 мл (таблица 8). Затем во все опытные пробирки внести по 0,2 мл суточной бульонной культуры испытуемых бактерий (E. coli).

Поставить контроль бактерий (КБ) на наличие роста. Пробирки поместить в термостат при 370С на 24 часа.

Таблица 8 – Схема определения чувствительности бактерий к антибиотикам

19