vse_metody_MIKROB

скопии. Подвижность можно определить по характеру роста бактерий в полу-

жидком агаре.

ПИЛИ (ворсинки, фимбрии) – тонкие нити белковой природы, покры-

вающие поверхность бактериальных клеток. Не выполняют двигательную функцию. Различают пили первого и второго типа.

Пили первого (общего) типа имеются у большинства бактерий. Осущест-

вляют прикрепление (адгезию) бактерий к определенным клеткам организма.

Адгезия является начальной стадией любого инфекционного процесса.

Пили второго типа, F-пили (конъюгативные или половые) есть у бакте-

рий, имеющих специальную плазмиду. Их количество невелико – 1-3 на клетку.

Половые пили представляют собой длинные пустые трубочки и выполня-

ют следующие функции:

-участвуют в передаче генетического материала от одной клетки к другой при конъюгации бактерий;

-являются рецепторами для адсорбции специфических вирусов бактерий –

бактериофагов.

Жгутики и пили у бактерий

9

Конъюгация у бактерий

4. Спорообразование у бактерий.

СПОРООБРАЗОВАНИЕ – это способ сохранения вида в неблагоприят-

ных условиях внешней среды, но не способ размножения. Споры устойчивы к высокой температуре, УФ-облучению, радиации, действию химических ве-

ществ, поэтому могут сохраняться в почве десятки лет (споры возбудителей си-

бирской язвы и столбняка). Споры круглой или овальной формы могут распо-

лагаться в клетке центрально, субтерминально (ближе к концу палочки) и тер-

минально (на конце палочки). Спора образуется в цитоплазме в течение 18-20

часов. Прорастание спор в вегетативные клетки начинается при их попадании в благоприятные условия и длится 4-5 часов.

Стадии спорообразования:

1. Подготовительная. В цитоплазме бактерий образуется уплотненный участок,

не имеющий свободной воды, называемый «спорогенной зоной». В ней содер-

жится нуклеоид.

2. Стадия предспоры. Вокруг спорогенной зоны образуется оболочка из двой-

ной ЦПМ.

3. Между двумя ЦПМ формируется кортекс, состоящий из пептидогликана. 4.

Стадия созревания. С внешней стороны наружной ЦПМ образуется оболочка

10

споры с повышенным содержанием солей кальция и липидов. Затем вегетатив-

ная часть клетки лизируется, освобождая спору.

Споры устойчивы во внешней среде за счет:

-низкого содержания воды, которая находится в связанном состоянии;

-наличия многослойной оболочки с повышенным содержанием солей кальция и липидов.

Споры обнаруживают в бактериальной клетке специальной окраской по методу Ожешко (спора окрашивается в ярко-красный цвет, вегетативная часть бактерии – в синий), или с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Спорообразующие бактерии:

Bacillus anthracis

Clostridium perfringens

Clostridium tetani

Clostridium botulinum

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

1. Окраска препарата по Бурри-Гинсу для выявления капсул. Смешивают каплю взвеси микробов с каплей туши и при помощи стекла со шлифованным краем готовят мазок, затем высушивают и фиксируют. На остывшее стекло наливают фуксин Пфейффера (1-2 минуты), промывают водой, высушивают и микроско-

пируют. В результате окраски бактерии окрашиваются в красный цвет, а неок-

рашенные (бесцветные) капсулы контрастно выделяются на черно-розовом фо-

не.

2. Окраска препарата по Нейссеру для выявления зерен волютина. На фиксиро-

ванный мазок наносят уксуснокислый метиленовый синий (1 минута), промы-

вают водой, затем наносят раствор Люголя (30 секунд), промывают водой и до-

крашивают хризоидином (10-15 секунд). Затем промывают водой, высушивают

11

и микроскопируют. В результате окраски бактерии приобретают нежно-желтый цвет, а зерна волютина – темно-синий.

3. Приготовление и окраска препарата по Цилю-Нильсену для выявления ки-

слотоустойчивых (вакцинный штамм туберкулезных палочек (BCG)) и кисло-

топодатливых (стафилококки) микроорганизмов.

Окраска по Цилю-Нильсену:

-на фиксированный мазок положить полоску фильтровальной бумаги, затем нанести небольшое количество карболового фуксина Циля;

-нагреть мазок над пламенем спиртовки 2-3 раза до появления пара, не доводя до кипения;

-снять бумагу, дать препарату остыть и погрузить его в стаканчик с 5% раство-

ром серной кислоты 2-3 раза (для обесцвечивания);

-мазок промыть водой и докрасить метиленовым синим 3-5 минут.

Врезультате окраски вакцинный штамм туберкулезных бактерий приобре-

тает красный цвет, а стафилококки – синий.

4 Окраска препарата по Ожешко для выявления спор.

При обычных способах окраски споры не прокрашиваются, оставаясь бес-

цветными внутри окрасившихся вегетативных клеток. Поэтому для размягче-

ния оболочки, или «протравливания», их обрабатывают 0,5% раствором соля-

ной кислоты. Затем препарат окрашивают по методу Циля-Нильсена, в резуль-

тате окраски споры приобретают рубиново-красный цвет, а вегетативные клет-

ки – синий.

5. Окраска препарата по Романовскому-Гимзе для выявления нуклеоида.

Препарат фиксируют метиловым спиртом, наносят краситель Романовского-

Гимзы (краситель представляет собой смесь двух красок – азура и эозина в рав-

ных частях), через 20-30 минут краску сливают, промывают препарат дистил-

лированной водой, высушивают и микроскопируют.

12

В результате окраски нуклеоид приобретает фиолетовый цвет и располага-

ется диффузно в цитоплазме, окрашенной в бледно-розовый цвет.

6. Окраска препарата по Морозову для выявления жгутиков.

Препарат фиксируют раствором ледяной уксусной кислоты 1 минуту, промы-

вают водой, наносят дубящий раствор танина, промывают водой и обрабаты-

вают препарат при подогревании раствором азотнокислого серебра 1-2 минуты,

промывают водой, высушивают и микроскопируют.

В результате окраски жгутики приобретают светло-желтый цвет, а клетки темно-коричневый.

7. Провести микроскопию мазков Klebsiella pneumoniaе в окраске по Бурри-

Гинсу для выявления капсул, Bacillus mesentericus в окраске по Романовскому-

Гимзе для выявление нуклеоида, Corynebacterium diphtheriaе в окраске по Нейссеру для выявления зерен волютина, Bacillus mesentericus в окраске по Морозову для выявления жгутиков, Bacillus anthracis в окраске по Ожешко для выявления спор, смеси культур вакцинных штаммов туберкулезных палочек

(BCG) и стафилококков в окраске по Цилю-Нильсену для выявления кислото-

устойчивых и кислотоподатливых бактерий.

8. Зарисовать поля зрения.

13

14

Занятие № 5

Тема. Химический состав бактериальной клетки. Питание и дыхание бакте-

рий. Питательные среды. Бактериологический метод исследования. Выделе-

ние чистых культур аэробов и анаэробов.

Цель занятия. Изучить особенности питания и дыхания бактерий. Знать эта-

пы бактериологического метода диагностики.

I.Теоретические знания

1.Химический состав бактериальной клетки, его особенности.

2.Питание бактерий. Механизмы поступления питательных веществ в клетку.

Классификация бактерий по типам питания и способам получения энергии.

Сапрофиты. Паразиты.

3.Культивирование бактерий. Питательные среды для бактерий, их классифи-

кация.

4.Дыхание бактерий. Классификация бактерий по типу дыхания.

5.Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Мето-

ды культивирования бактерий. Получение чистой культуры аэробов и ана-

эробов. Способы создания анаэробных условий.

II.Практические навыки

1.Овладение основными приемами бактериологической техники.

2.Проведение бактериологического исследования (по схеме): выполнение I

этапа выделения чистой культуры аэробов из исследуемого материала, со-

держащего смесь бактерий. Техника посева исследуемого материала петлей на пластинчатый МПА (в чашке Петри) с целью получения изолированных колоний.

1

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1. Химический состав бактериальной клетки, его особенности.

Вода составляет более 80% массы микробной клетки и находится в сво-

бодном и связанном состоянии (коллоидно-связанная и ионно-связанная).

Функции свободной воды:

является универсальным растворителем;

обеспечивает оптимальные условия для переноса метаболитов;

обеспечивает процессы осмоса и диффузии.

Связанная вода входит в состав молекул органических и неорганических соединений и является структурным элементом цитоплазмы бактерий.

Сухой остаток бактериальной клетки включает в себя неорганические и ор-

ганические вещества.

К неорганическим веществам относят: углерод, азот, фосфор, калий,

магний, натрий, серу, железо, медь, цинк и др. Они участвуют в процессах ме-

таболизма клетки. Некоторые неорганические вещества (железо, магний) сти-

мулируют рост большинства болезнетворных бактерий.

К органическим веществам относят: белки, углеводы, липиды и нуклеи-

новые кислоты.

Белки составляют 50-80% сухого веса бактерий, выполняют строительную и ферментативную функции, участвуют в транспорте питательных веществ, яв-

ляются экзотоксинами.

Углеводы составляют 12-18% сухого веса клетки, качественно много-

образны и представлены моносахаридами, дисахаридами, полисахаридами и др.

Основная масса углеводов представлена полисахаридами. Углеводы обеспечи-

вают энергетику клетки, входят в состав эндотоксинов и некоторых структур-

ных компонентов бактериальной клетки.

Липиды – их количество варьирует в широких пределах (9-41%) в зави-

симости от видовой и родовой принадлежности бактерий. Липиды, так же, как и углеводы, качественно многообразны и представлены фосфолипидами, ней-

2

тральными жирами, свободными жирными кислотами. В бактериальной клетке преобладают фосфолипиды. Липиды придают устойчивость бактериальной клетке во внешней среде, обеспечивают энергетику клетки при недостатке уг-

леводов, выполняют строительную функцию, входят в состав эндотоксинов,

обладают пирогенными свойствами (повышение температуры тела при инфек-

ционном заболевании).

Нуклеиновые кислоты представлены ДНК (3%) и РНК (16%), структура и функции которых сходны с нуклеиновыми кислотами эукариот. Процентное содержание Г+Ц в ДНК, характерное для отдельных видов, родов и семейств,

используется в построении систематики микроорганизмов.

3

2.Питание бактерий. Механизмы поступления питательных веществ

вклетку. Классификация бактерий по типам питания и способам получе-

ния энергии. Сапрофиты. Паразиты.

Общий тип питания у бактерий голофитный, т.е. через всю поверхность клетки. Основным барьером, регулирующим поступление питательных веществ в клетку, является ЦПМ, т.к. в ней очень мелкие поры, непроницаемые для крупных молекул.

Механизмы поступления питательных веществ в клетку:

простая диффузия происходит по градиенту концентрации, без затрат энер-

гии. Таким путем в клетку проникают вода и газы (02, Н2, N2);

облегченная диффузия – по градиенту концентрации, без затрат энергии, с

помощью специальных белков-переносчиков – пермеаз;

активный механизм осуществляется против градиента концентрации с за-

тратой энергии при помощи белков-переносчиков – пермеаз. Имеется два типа активного транспорта: 1 – «накачивание» небольших молекул в клет-

ку с созданием концентрации, в 100-1000 раз превышающей концентрацию этого вещества снаружи клетки. 2 – транслокация (перенос) радикалов, со-

провождающаяся химической модификацией переносимого вещества (фос-

форилирование глюкозы, фруктозы).

4