vse_metody_MIKROB

Строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных

бактерий

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

1. С помощью преподавателя освоить технику приготовления мазка культур бактерий из жидкой и с плотной питательных сред.

Этапы приготовления мазка:

1.Собственно приготовление мазка.

-обезжирить предметное стекло сухим мылом и обвести снизу границы маз-

ка карандашом по стеклу;

-приготовление мазка из жидкой питательной среды: прокалить петлю, над спиртовкой открыть пробку пробирки, обжечь края пробирки, набрать кап-

лю культуры петлей. Снова обжечь края пробирки и закрыть пробкой. Про-

бирку поставить в штатив, нанести каплю культуры на предметное стекло и распределить петлей параллельными движениями (диаметр мазка – 0,5-

1см). Прокалить петлю;

-приготовление мазка с плотной питательной среды: прокалить петлю, над спиртовкой открыть пробирку с физиологическим раствором, обжечь края пробирки и набрать петлей каплю физиологического раствора. Снова об-

7

жечь края пробирки и закрыть пробкой. Нанести каплю на предметное стек-

ло. Затем прокалить петлю, над спиртовкой открыть пробирку с плотной питательной средой, обжечь края пробирки. С поверхности плотной среды взять петлей немного культуры бактерий, снова обжечь края пробирки и за-

крыть пробкой. Внести культуру в каплю физ. раствора, распределить мик-

робную взвесь параллельными движениями (диаметр мазка – 0,5-1см). Про-

калить петлю.

2.Высушить мазок высоко над пламенем спиртовки.

3.Фиксировать мазок жаром. Для этого стекло 3 раза внести в среднюю треть пламени спиртовки на 1-2 секунды. Приступить к окрашиванию мазка.

2.Самостоятельно приготовить мазки из культур стафилококков (плотная пита-

тельная среда) и кишечных палочек (жидкая питательная среда).

Окрасить мазок стафилококков метиленовым синим – 3 минуты, а мазок кишечных палочек фуксином Пфейффера – 1 минуту. Промыть мазки водой и высушить фильтровальной бумагой.

3. Приготовить мазки из смесей культур: S.epidermidis + E.сoli и B.anthracoides + E.coli. Окрасить мазки по Граму.

4.Микроскопировать приготовленные препараты.

5.Зарисовать препараты.

6. Убрать рабочее место.

8

Занятие №3

Тема. Строение бактериальной клетки. Кислотоустойчивые бактерии. Окраска по Цилю-Нильсену. Спорообразование у бактерий и его значение.

Цель занятия. Изучить строение бактериальной клетки, процесс спорообразо-

вания у бактерий. Освоить методику окраски препаратов по методу Циля-

Нильсена.

I.Теоретические знания:

1.Оболочечные структуры бактериальной клетки: капсула (капсульный слой),

клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана. Особенности клеточной стен-

ки кислотоустойчивых бактерий. Окраска по Цилю-Нильсену. Механизм окра-

ски. L-формы бактерий, их медицинское значение. Микоплазмы.

2. Цитоплазма, ее составные: нуклеоид (генофор), плазмиды, рибосомы, мезо-

сомы, включения.

3.Поверхностные структуры бактериальной клетки: жгутики, пили.

4.Спорообразование у бактерий.

II.Практические навыки:

1.Приготовление мазка кислотоустойчивых (вакцинные туберкулезные бакте-

рии – BCG) и кислотоподатливых (стафилококки) бактерий.

2. Окраска мазка по Цилю-Нильсену.

1

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

К основным структурам бактериальной клетки относят оболочечные

структуры, цитоплазму и органеллы.

Строение бактериальной клетки

1.Оболочечные структуры бактериальной клетки.

Коболочечным структурам бактериальной клетки относят капсульный слой, клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану.

Снаружи многие бактерии имеют КАПСУЛЬНЫЙ СЛОЙ (МИКРО-

КАПСУЛУ). Это слизистое образование, не превышающее диаметр бактери-

альной клетки. У некоторых бактерий имеется ИСТИННАЯ КАПСУЛА – сли-

зистый слой, превышающий диаметр бактериальной клетки. Капсула не являет-

ся обязательной структурой. У большинства бактерий она имеет полисахарид-

ную природу. У некоторых (Bacillus anthracis) – состоит из белка.

2

Большинство бактерий образуют капсулу только в макроорганизме

(in vivo):

Streptococcus pneumoniaе – возбудитель крупозной пневмонии;

Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы;

Clostridium perfringens – возбудитель газовой гангрены;

Francisella tularensis – возбудитель туляремии;

Yersinia pestis – возбудитель чумы.

Некоторые бактерии образуют капсулу в макроорганизме и на питательной среде (in vivo и in vitro):

Klebsiella pneumoniaе – возбудитель пневмонии;

Klebsiella oxytoca– возбудитель сепсиса, инфекций мочевыводящих путей;

Klebsiella granulomatis – возбудитель паховой гранулемы.

Функции капсулы:

-в макроорганизме защищает бактерии от фагоцитоза и действия антител;

-во внешней среде предохраняет бактерии от высыхания.

Капсулу выявляют в окраске по Бурри-Гинсу. В результате окраски бакте-

рии красного цвета, вокруг них бесцветные капсулы на черно-розовом фоне.

Klebsiella pneumoniaе в окраске по Бурри-Гинсу

3

КЛЕТОЧНАЯ СТЕНКА представляет собой биополимер – пептидогликан (муреин), являющийся плотной структурой. По строению клеточной стенки грамположительные и грамотрицательные бактерии существенно отличаются друг от друга (см. занятие №2).

Функции клеточной стенки:

-придает клетке постоянную форму;

-защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление;

-участвует в транспорте метаболитов;

-несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов (вирусов бактерий) и различных химических веществ.

КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫЕ БАКТЕРИИ имеют особый химический состав клеточной стенки с повышенным количеством липидов и жирных кислот (миколовой и миколеновой).

К ним относят:

Mycobacterium tuberculosis – возбудитель туберкулеза;

Mycobacterium leprae – возбудитель лепры;

Mycobacterium africanum – возбудитель эндемического туберкулеза в Африке;

Mycobacterium scrofulaceum – возбудитель лимфаденитов у детей;

Mycobacterium smegmatis – нормальный симбионт мочеполовой системы мужчин.

Кислотоустойчивые бактерии плохо воспринимают красители. Для их окраски и дифференцировки от других бактерий используют метод Циля-

Нильсена.

4

Окраска по Цилю-Нильсену. Механизм окраски.

- на фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги и наносят карболовый фуксин Циля. Над пламенем спиртовки подогревают мазок

2-3 раза до появления пара; - бумагу снимают, препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты,

погружая в стаканчик с кислотой 2-3 раза;

-промывают водой, окрашивают метиленовым синим 3-5 минут;

-промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, кислотопо-

датливые – в синий.

Механизм окраски:

При обработке препарата карболовым фуксином Циля все клетки окраши-

ваются в красный цвет. При последующем обесцвечивании серной кислотой кислотоустойчивые бактерии из-за особенностей своего химического состава удерживают краситель. Кислотоподатливые – обесцвечиваются, поэтому при дальнейшем окрашивании метиленовым синим воспринимают краситель и приобретают синий цвет.

L-формы бактерий, их медицинское значение.

L-формы (от названия Института им. Д. Листера, где они впервые были изучены) – это бактерии, полностью или частично лишенные клеточной стенки,

но способные к размножению. Имеют своеобразную морфологию в виде круп-

ных и мелких сферических клеток.

L-трансформации могут подвергаться все бактерии, имеющие клеточную

стенку.

L-трансформация происходит под действием различных индуцирующих факторов (антибиотики, угнетающие биосинтез клеточной стенки, лизоцим и др.). В результате бактерии становятся устойчивыми к некоторым антибиоти-

кам.

5

L-трансформация может быть обратимой и необратимой. Обратимая –

наблюдается при сохранении генетического контроля синтеза клеточной стенки и тогда бактерии реверсируют в исходную форму.

L-формы могут образовывать многие возбудители инфекционных заболе-

ваний. Это одна из причин хронизации заболеваний и форм приспособления бактерий к неблагоприятным условиям существования.

МИКОПЛАЗМЫ (УРЕАПЛАЗМЫ) – бактерии, лишенные клеточной стенки. Ее функции выполняет цитоплазматическая мембрана. В отличие от других бактерий, микоплазмы быстрее погибают в неблагоприятных условиях,

но устойчивы к действию бактериофагов (вирусов бактерий).

ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА (ЦПМ) располагается под клеточной стенкой. Представляет собой трехслойную мембрану. Состоит из

двойного слоя липидов и белков, пронизывающих липидные слои.

Функции ЦПМ:

-является основным осмотическим и онкотическим барьером;

-участвует в энергетическом метаболизме и активном транспорте пита-

тельных веществ в клетку, т.к. является местом локализации пермеаз и фермен-

тов окислительного фосфорилирования;

-участвует в процессах дыхания и деления;

-участвует в синтезе компонентов клеточной стенки (пептидогликана);

-участвует в выделении из клетки токсинов и ферментов.

ЦПМ выявляется при электронной микроскопии.

2. Цитоплазма, ее составные.

Цитоплазма занимает основной объем бактериальной клетки. Представля-

ет собой аморфный матрикс, содержащий различные органические соединения,

органеллы и включения.

6

-нуклеоид – внутренняя зона цитоплазмы. Представлен одной кольцевой молекулой ДНК, содержащей около 2000 генов. Нуклеоид не имеет ядерной оболочки, ядрышек и основных белков (гистонов). Содержит одну хромосому, имеет гаплоидный (одиночный) набор генов, поэтому клетка не способна к митотическому делению. Нуклеоид выявляется специальными методами окраски (по Романовскому-Гимзе и др.) и электронной микроскопией;

-плазмиды – факторы внехромосомной наследственности, автономно присутствующие в цитоплазме в виде небольших молекул ДНК. Гены плазмид могут придавать бактериям новые свойства, способствующие их выживанию.

Особое значение в медицине имеют плазмиды, обеспечивающие устойчивость бактерий к антибиотикам. У патогенных бактерий плазмиды кодируют факторы, способствующие развитию инфекционного процесса;

- рибосомы – состоят из двух субъединиц, но отличаются от рибосом эукариот молекулярной массой. Функция рибосом – синтез белка. Индикация 16S

рРНК бактерий является основой метода пиросеквенирования (см. занятие №1);

-мезосомы – являются производными ЦПМ при впячивании ее участков в цитоплазму. Функции: участвуют в энергетическом метаболизме, в процессах деления и спорообразования;

-включения образуются в процессе жизнедеятельности клетки и выполняют резервную (трофическую и энергетическую) функцию. Они представлены гранулами гликогена, крахмала, каплями жира, минеральными веществами – серой, кальцием, железом и др., а также зернами волютина. Зерна волютина по химической природе полифосфаты – являются запасным источником энергии. Для обнаружения зерен волютина используют метод окраски по Нейссеру. В результате окраски бактерии приобретают нежно-желтый цвет, а зерна волютина – темно-синий.

Зерна волютина имеют:

Spirillum volutans– сапрофит;

Corynebacterium diphtheriaе – возбудитель дифтерии;

Corynebacterium xerosis– нормальный симбионт конъюнктивы;

7

Corynebacterium ulcerans – возбудитель дифтериеподобных поражений

кожи.

3. Поверхностные структуры бактериальной клетки: жгутики, пили.

Бактерии подразделяют на подвижные и неподвижные. Органами движе-

ния у бактерий являются ЖГУТИКИ. Они состоят из белка флагеллина, кото-

рый по своей структуре относят к сократительным белкам типа миозина. Осно-

ванием жгутика является базальное тельце, состоящее из системы дисков, «вмонтированных» в ЦПМ и клеточную стенку. Длина жгутика больше длины самого микроба.

По числу жгутиков и их расположению бактерии подразделяют:

-монотрихи, имеющие на конце клетки один жгутик (Vibrio choleraе);

-лофотрихи, имеющие пучок жгутиков на одном из концов клетки (Helicobacte rpylori);

-амфитрихи, имеющие жгутики на обоих концах клетки (Spirillum volutans);

-перитрихи, имеющие жгутики по всему периметру клетки (Escherichia coli, Salmonella typhi).

Жгутики очень тонкие, поэтому их можно обнаружить только специаль-

ной обработкой, при которой достигается увеличение их размера. Жгутики выявляют окраской по Морозову, электронной микроскопией. Движение мик-

робов наблюдают с помощью темно-полевой или фазово-контрастной микро-

8