vse_metody_MIKROB
.pdfжении резистентности макроорганизма могут вызывать микозы (кандидозы) с
поражением кожи, слизистых оболочек, внутренних органов.
Чистая культура Candida albicans. Окраска по Граму
ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА
1. Порядок работы с иммерсионной системой светового микроскопа.
Вывести объектив ×90 на оптическую ось микроскопа. Включить освети-
тель. На предметное стекло с препаратом нанести каплю иммерсионного масла и положить на предметный столик микроскопа. Погрузить объектив в каплю масла и слегка приподнять. Смотря в окуляр, макровинтом опустить объектив до появления изображения. Четкость изображения достигается работой микро-
винта.
После изучения препарата выключить осветитель, поднять тубус микро-
скопа, снять препарат со столика, не вытирая иммерсионного масла. С фрон-
тальной линзы объектива удалить масло специальной салфеткой. Децентриро-
вать объективы. Опустить тубус до соприкосновения объективов с предметным столиком. Шнур осветителя завернуть вокруг станины микроскопа. Микроскоп поставить в шкаф.
2. Провести микроскопию:
21
- демонстрационных окрашенных препаратов стафилококков, стрептокок-
ков, менингококков, сарцин, кишечной палочки, сибиреязвенных бацилл, виб-
рионов, лептоспир, актиномицетов, кандид; - нативных препаратов гнойного отделяемого уретры больного острой
мужской гонореей (окраска метиленовым синим), мазка-отпечатка биоптата слизистой оболочки желудка больного хроническим гастритом (окраска по Граму), крови больного эпидемическим возвратным тифом и отделяемого твер-
дого шанкра больного первичным сифилисом (окраска по Романовскому-
Гимзе).
3. Провести микроскопию агаровых культур плесневых грибов под малым уве-
личением микроскопа.
4. Зарисовать поля зрения.
К О К К И
Staphylococcus |
Streptococcus |
Streptococcus |
aureus |
pyogenes |
pneumoniae |
Neisseria |
Neisseria |
Sarcina |
meningitidis |
gonorrhoeae |
ventriculi |
|
22 |
|
П А Л О Ч К О В И Д Н Ы Е
Escherichia |
Vibrio |
Bacillus |
coli |
cholerae |
anthracis |
|
И З В И Т Ы Е |
|
Leptospira |
Borrelia |
Treponema |
interrogans |
recurrentis |
pallidum |
Helicobacter |
Actiпоmyces |
pylori |
|
|
23 |
М И К Р О С К О П И Ч Е С К И Е Г Р И Б Ы
Candida albicans |
Penicillium |
Aspergillus |
Mucor |
5. Убрать рабочее место. |
|
24
Занятие № 2
Тема. Виды микроскопии. Техника приготовления и окрашивания бактериоло-
гического препарата (мазка). Простые и сложные методы окраски препаратов.
Цель занятия. Ознакомиться с видами микроскопии, используемыми для ди-
агностики инфекционных заболеваний. Освоить технику приготовления мазков микроорганизмов с плотной и жидкой питательных сред. Освоить простой и сложный (по Граму) методы окраски препаратов.
I.Теоретические знания:
1.Виды микроскопии, используемые в медицинской микробиологии.
2.Техника приготовления и окрашивания бактериологического препарата.
Принцип простого и сложного методов окраски.
3. Окраска по Граму, механизм окраски. Примеры грамположительных и гра-
мотрицательных бактерий.
II.Практические навыки:
1.Приготовление мазков микроорганизмов с плотной и жидкой питательных сред.
2.Окраска препаратов простым методом.
3.Окраска препаратов сложным (по Граму) методом.
1
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ
1. Виды микроскопии, используемые в медицинской микробиологии.
Для диагностики инфекционных заболеваний используют световой, тем-
нополевой, фазово-контрастный, люминесцентный и электронный микроскопы.
Общее увеличение микроскопа определяют произведением увеличений
объектива и окуляра.
Разрешающая способность микроскопа – это наименьшее расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно.
СВЕТОВОЙ МИКРОСКОП.
Разрешающая способность 0,2 мкм.
Предназначен для изучения формы, размеров и структуры окрашенных клеток.
При исследовании микроорганизмов применяют иммерсионный объек-
тив. Его преимущество – с помощью иммерсионного масла устанавливается оптически однородная среда с одинаковым показателем преломления между стеклом и линзой. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя на-
правления, попадают в объектив, чем достигается более высокая разрешающая способность. В качестве иммерсионного масла обычно используют кедровое или касторовое, показатель преломления которых равен показателю преломле-
ния света в стекле.
ТЕМНОПОЛЕВОЙ МИКРОСКОП (ультрамикроскоп).
Разрешающая способность – 0,02-0,04 мкм.
Предназначен для изучения формы, размеров и подвижности живых, неок-
рашенных бактерий.
Темное поле создается с помощью специального конденсора, в котором за-
темнена центральная часть и таким образом создается боковое освещение. По-
этому в объектив попадают лучи, отраженные от объекта. Увеличение разре-
2
шающей способности микроскопа связано с тем, что отраженный луч имеет бо-
лее короткую длину волны.
ФАЗОВО-КОНТРАСТНЫЙ МИКРОСКОП.
Разрешающая способность – 0,2 мкм.
Предназначен для изучения формы, подвижности и структуры живых не-
окрашенных бактерий.
Имеет специальный набор фазовых объективов и соответствующих им кольцевых диафрагм конденсора. С помощью этого устройства достигается преобразование невидимых фазовых колебаний преломленного луча в видимые амплитудные колебания.
ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МИКРОСКОП.
Разрешающая способность – 0,2 мкм.
Предназначен для экспресс-диагностики вирусных и бактериальных ин-
фекций.
Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых ве-
ществ светиться под действием коротковолновых ультрафиолетовых (УФ) лу-
чей. Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными люминесцентными красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый,
аурамин и др.). В качестве источника УФ-света обычно используют ртутно-
кварцевую лампу. Под действием УФ-излучения окрашенные клетки начинают светиться красным или зеленым светом.
ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП.
Разрешающая способность – менее 1Å (Å – ангстрем).
Предназначен для изучения строения вирусов, бактерий и отдельных мак-
ромолекул.
Высокая разрешающая способность достигается малой длиной волны электронов. В электронном микроскопе вместо света используют поток элек-
3
тронов в безвоздушной среде. Источником электронов является вольфрамовая нить катода, разогреваемая до высокой (2500-29000С) температуры. Роль опти-
ческих линз выполняют электромагниты. Для исследования препаратов в элек-
тронном микроскопе применяют специальные пленки, проницаемые для элек-
тронов.
2.Техника приготовления и окрашивания бактериологического препара-
та. Принцип простого и сложного методов окраски.
Этапы приготовления мазка:
1.Собственно приготовление мазка.
2.Высушивание.
3.Фиксация.
4.Окрашивание.
1.Собственно приготовление мазка:
из культуры бактерий, выращенной в жидкой питательной среде:
-обезжирить предметное стекло;
-нанести на стекло с помощью бактериологической петли каплю культуры
ираспределить ее параллельными движениями;
из культуры бактерий, выращенной на плотной питательной среде:
-на обезжиренное стекло нанести каплю физиологического раствора, за-
тем внести в эту каплю петлей небольшое количество культуры бактерий с
плотной питательной среды и распределить параллельными движениями.
2.Высушивание мазка на воздухе или высоко над пламенем спиртовки (в
струе теплого воздуха).
3.Фиксация мазка:
жаром, в пламени спиртовки – при изучении формы и расположения бакте-
рий и дифференциации их при окраске сложным методом;
4
химическим методом – при изучении нативных (сохранивших естественную структуру) препаратов от больного (кровь, ликвор, гной и т.д.). В качестве хи-
мических фиксаторов чаще используют этиловый и метиловый спирт, а также смесь Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в соотношении 1:1).
Цель фиксации:
-убить микроорганизмы;
-прикрепить их к предметному стеклу;
-улучшить их прокрашивание.
4.Окрашивание препарата простым и сложным методом.
Простой метод окраски позволяет изучать форму, размеры и взаиморас-
положение бактерий. Для окраски используют только один краситель, чаще фуксин Пфейффера или метиленовый синий.
Принципиальный рецепт простого водно-спиртового красителя:
1 часть красителя
+
10 частей 96о этилового спирта
+
100 частей дистиллированной воды
Сложные методы окраски позволяют дифференцировать микроорганизмы
(окраска по Граму, Цилю-Нильсену) или видеть отдельные структуры клеток
(окраска по Бурри-Гинсу, Нейссеру, Романовскому-Гимзе). Для окраски ис-
пользуют более одного красителя.
3. Окраска по Граму. Примеры грамположительных и грамотрицательных
бактерий. Механизм окраски.
Окраска по Граму (в модификации Синѐва):
-на фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитан-
ную генциан-фиолетовым, смачивают водой, окрашивают 2 минуты;
5
-снимают бумагу и наносят на мазок раствор Люголя на 1 минуту, затем кра-
ситель сливают;
-обесцвечивают мазок 96о спиртом 10-15 секунд;
-промывают мазок водой;
-докрашивают мазок фуксином Пфейффера 30 секунд;
-промывают мазок водой, высушивают фильтровальной бумагой и микро-
скопируют.
Механизм окраски по Граму.
Дифференцировка на грамположительные и грамотрицательные бактерии зависит от строения клеточной стенки, основой которой является пептидогли-
кан. У грамположительных бактерий толщина пептидогликана 500Å, у грамот-
рицательных – не более 150Å.
При окрашивании препарата генциан-фиолетовым, а затем раствором Лю-
голя, образуется комплекс генциан-фиолетовый + йод. Все клетки окрашивают-
ся в сине-фиолетовый цвет. При обработке спиртом у грамположительных бак-
терий образовавшийся комплекс не обесцвечивается. Поэтому при окрашива-
нии фуксином Пфейффера они сохраняют сине-фиолетовый цвет. У грамотри-
цательных бактерий комплекс генциан-фиолетовый + йод обесцвечивается спиртом и при окраске фуксином Пфейффера они приобретают розово-красный цвет.
В результате окраски бактерии дифференцируют на грамположительные
(сине-фиолетовые) или грамотрицательные (розово-красные).
К грамположительным относят все кокки (кроме нейссерий) и спорообра-
зующие бактерии. К грамотрицательным – нейссерии, неспорообразующие бак-
терии, спириллы.
6