vse_metody_MIKROB
.pdfтител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностически значи-
мой является сероконверсия для взрослых в 4 раза, а для детей – в 2 раза.
Практическая работа
1. Изучение под микроскопом готовых препаратов включений Бабеша-
Негри (окраска по Селлерсу). Краситель Селлерса состоит из 2-х частей 1%
раствора метиленовой сини в метиловом спирте и 1 части 1% раствора основ-
ного фуксина в метиловом спирте. Этот краситель наносят на 1-5 секунд на влажный, нефиксированный мазок-отпечаток из ткани мозга, чаще из области гиппокампа (аммонова рога) человека или животного, погибшего от бешенства.
При световой микроскопии с иммерсионной системой на голубом фоне цито-
плазмы нейронов видны ярко-красные включения Бабеша-Негри. Включения четко контурированы, имеют овальную или продолговатую форму и зернистую структуру.
2. Вирусологический метод диагностики.
а) культивирование вирусов в курином эмбрионе.
I этап исследования: заражение куриных эмбрионов в аллантоисную по-
лость материалом от больного с подозрением на гриппозную инфекцию.
С помощью овоскопа определяют расположение и границы воздушной ка-
меры (отметить карандашом). Скорлупу яйца в области воздушной камеры об-
рабатывают спиртовым раствором йода. Пробойником делают отверстие в цен-
тре камеры, затем шприцем вводят вируссодержащую жидкость в количестве
0,1-0,2 мл в аллантоисную полость. Отверстие парафинируют. Зараженные эм-
брионы помещают в термостат при 370С на 48 часов.
б) культивирование вирусов в культуре клеток Нер-2.
I этап исследования: приготовление перевиваемой культуры клеток Нер-2.
Для получения монослоя культуры клеток количество клеток во взвеси подсчитывают в камере Горяева. Взвесь клеток разводят средой 199 до количе-
ства 100 тысяч клеток в 1мл. В стерильный пенициллиновый флакон вносят стерильной пипеткой над пламенем спиртовки 1мл взвеси клеток в питательной
13
среде 199, закрывают флакон стерильной резиновой пробкой. На флаконе ка-
рандашом по стеклу проводят продольную черту. Затем помещают флакон в специальный штатив в горизонтальном положении, чертой кверху, и ставят в термостат при 370С на 3-5 дней для получения монослоя клеток на стенке фла-
кона.
II этап исследования:
микроскопический контроль выросшей культуры клеток Нер-2. Под ма-
лым увеличением микроскопа просматривают культуру клеток. Для заражения отбирают флаконы с полноценным монослоем (видны прозрачные, блестящие клетки, имеющие отростки, прикрепленные к стеклу);
заражение культуры клеток смывом из носоглотки больного с подозре-
нием на аденовирусную инфекцию. Во флакон с полноценным монослоем кле-
ток над пламенем спиртовки вносят стерильной пипеткой вируссодержащую жидкость в объеме 0,1мл. Затем второй стерильной пипеткой добавляют во флакон 0,9мл среды 199 с бычьей сывороткой. Флаконы с зараженной культу-
рой клеток укладывают в штатив и ставят в термостат при 370С на 48-72 часа.
14
Занятие №2
Тема. Вирусологический метод диагностики. Интерфероны, классификация,
механизм действия, практическое применение. Особенности противовирусного иммунитета.
Цель занятия. Освоить принципы индикации и идентификации вирусов.
Изучить особенности противовирусного иммунитета.
I.Теоретические знания:
1.Вирусологический метод диагностики. Методы индикации и идентификации вирусов.
2.Интерфероны, классификация. Механизм действия. Практическое примене-
ние.
3.Особенности противовирусного иммунитета
II.Практические навыки:
1.Провести вскрытие куриного эмбриона и взятие вируссодержащей алланто-
исной жидкости.
2.Определить наличие вируса гриппа в аллантоисной жидкости куриного эм-
бриона с помощью реакции гемагглютинации.
3.Провести идентификацию вируса гриппа в реакции торможения гемагглюти-
нации.
4.Провести учет цитопатогенного действия аденовирусов на культуру клеток.
5.Провести идентификацию аденовирусов с помощью реакции нейтрализации
вкультуре клеток.
1
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ
1.Вирусологический метод диагностики. Методы индикации и идентифи-
кации вирусов.
Методы индикации вирусов
Индикацию (обнаружение) вирусов в материале от больного проводят
различными способами. Они зависят от метода культивирования вируса:
Если вирус способен размножаться в курином эмбрионе, то для его обна-
ружения используют реакцию гемагглютинации (РГА). Она основана на спо-
собности таких вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты с помощью фермента «гемагглютинина», расположенного в суперкапсиде вируса. В ре-
зультате реакции in vitro наблюдается осадок эритроцитов в виде «перевернуто-
го зонтика» – это положительный результат РГА. При отрицательной реакции – выпадает осадок эритроцитов с ровными краями. Используют для индикации
вирусов гриппа.
Индикацию вирусов, культивируемых в культуре клеток, можно прово-
дить по их цитопатогенному действию (ЦПД) на клетки (рисунок 5). Это дей-
ствие выражается в повреждении монослоя зараженной культуры клеток и из-
менении их морфологии: клетки округляются, темнеют, теряют отростки, в них появляется зернистость. Эти изменения обозначают термином «дегенерация клеток». В дальнейшем происходит отслойка клеток от стекла – нарушение
монослоя. Используют для индикации аденовирусов. а) б)
Рисунок 5 – Культура клеток: нормальная (а), дегенерированная (б)
2
Индикацию вирусов, культивируемых в организме лабораторных живот-
ных, проводят по факту гибели животного. Используют для индикации вируса бешенства.
Методы идентификации вирусов
Идентификацию вирусов проводят по антигенным свойствам с помощью серологических реакций со специфическими диагностическими противовирус-
ными сыворотками. Основными реакциями являются: реакция торможения ге-
магглютинации, реакция нейтрализации в культуре клеток или в организме жи-
вотного, реакция иммунофлюоресценции (РИФ) и иммуноферментный анализ
(ИФА).
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА): 2-компонентная, слож-
ная серологическая реакция.
Компоненты реакции: исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг), типо-
вые противовирусные диагностические сыворотки (Ат).
Индикатор реакции: 1% взвесь эритроцитов.
Постановка реакции: готовят разведения диагностических сывороток в лунках полистироловой пластины. К ним добавляют вируссодержащую жид-
кость и оставляют на 30-40 минут при комнатной температуре. Затем в лунки вносят взвесь эритроцитов. Учет реакции проводят через 1-2 часа.
Положительная реакция: тип вируса соответствует типу сыворотки. Ви-
русный гемагглютинин блокируется антителами сыворотки, поэтому агглюти-
нация эритроцитов отсутствует. Визуально в лунках определяется осадок
эритроцитов с ровными краями, в виде «пуговицы».
Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки. Ви-
русный гемагглютинин склеивает эритроциты. Визуально в лунках определяет-
ся осадок эритроцитов с неровными краями в виде «перевернутого зонти-
ка».
РТГА применяют для идентификации вирусов гриппа и других вирусов,
имеющих в суперкапсидной оболочке фермент гемагглютинин.
3
Реакция нейтрализации (РН) в культуре клеток: 2-компонентная,
сложная серологическая реакция.
Компоненты реакции: исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг), типо-
вые противовирусные диагностические сыворотки (Ат).
Индикатор реакции: культура клеток.
Постановка реакции: вируссодержащую жидкость смешивают в пробирках со специфическими диагностическими сыворотками. Оставляют на 1 час при комнатной температуре. Затем содержимым пробирок заражают культуры кле-
ток во флаконах.
Положительная реакция: тип вируса соответствует типу сыворотки. Про-
исходит нейтрализация вируса антителами сыворотки и культура клеток оста-
ется нормальной, без изменений.
Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки. Ви-
рус оказывает цитопатогенное действие, что приводит к дегенерации культу-
ры клеток.
РН в культуре клеток применяют для идентификации вирусов полиомие-
лита, аденовирусов и др.
РН можно также использовать для идентификации вирусов, культи-
вируемых в организме лабораторных животных. Компоненты и постановка реакции такие же, как в РН в культуре клеток. Индикатор реакции: лаборатор-
ное животное (в частности, белые мыши).
Положительная реакция: тип вируса соответствует типу диагностической сыворотки, происходит его нейтрализация антителами сыворотки и животное
остается здоровым.
Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки, жи-
вотное погибает.
РН в организме животного используется для идентификации вирусов бе-
шенства.
В таблице 2 представлены обобщенные данные о методах культивирова-
ния, индикации и идентификации вирусов.
4
Таблица 2 – Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов
Объекты культивирования |
Методы индикации |
Методы идентификации |
|
|
|
куриные эмбрионы |
РГА |
РТГА |
|
|
|
культура клеток |
дегенерация клеток |
РН в культуре клеток |
|
|
|
лабораторные животные |
гибель животных |
РН на лабораторных животных |
|
|
|
2. Интерфероны, классификация, механизм действия, практическое при-
менение
Интерфероны – гликопротеины, которые вырабатываются многими клет-
ками организма. Однако эта способность наиболее выражена у лейкоцитов,
фибробластов и лимфоцитов. Интерфероны (ИФ) являются цитокинами, подав-
ляющими размножение вирусов, определенных бактерий и некоторых раковых клеток.
По природе клеток, вырабатывающих ИФ, их делят на три группы: α-ИФ (лейкоцитарный): обладает выраженным противовирусным дейст-
вием;
β-ИФ (фибробластный): обладает противовирусным действием, а также регулирует работу лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (иммуномо-
дулирующее действие);
γ-ИФ (иммунный): продуцируется всеми Т-лимфоцитами, стимулирует активность Т- и В-лимфоцитов, фагоцитов, усиливает синтез молекул MHCI и
MHCII и др. Таким образом, γ-ИФ усиливает активность всех звеньев им-
мунной системы.
Механизм противовирусного действия интерферонов.
Интерфероны ингибируют внутриклеточную репликацию широкого спек-
тра ДНК- и РНК-содержащих вирусов.
Винфицированной клетке синтезируется ИФ, выходит из нее, связывается
споверхностью здоровой клетки и индуцирует в ней синтез антивирусных бел-
ков. Если в эту клетку проникает вирус, то его репродукция подавляется этими
белками. Один из них является ферментом рибонуклеазой, которая разрушает
5
мРНК вируса. Второй фермент – протеинкиназа – блокирует синтез вирусных белков. Репродукция вируса становится невозможной.
Практическое использование интерферона для лечения и профилактики вирусных инфекций связано с использованием препаратов на основе генно-
инженерного рекомбинантного α2-ИФ. Его получают в культуре бактерий по-
сле встраивания в их геном гена человеческого α-ИФ. Рекомбинантный α2-ИФ эффективен для лечения хронических гепатитов В и С, герпетической и папил-
ломавирусной инфекции.
3. Особенности противовирусного иммунитета.
Интерфероны (гликопротеины) продуцируются клетками при вирусной ин-
фекции. Являются первой, наиболее ранней линией защиты (через несколько часов после начала размножения вируса).
Основными клетками, осуществляющими в организме противовирусный им-
мунологический надзор, являются ЦТЛ и NK-клетки. Они разрушают инфи-
цированные вирусом клетки с помощью перфоринов и гранзимов.
Т-лимфоциты и интерфероны приводят организм к выздоровлению, но не формируют приобретенного иммунитета.
Противовирусные антитела (секреторные IgA и сывороточные IgM и G) за-
щищают только при внеклеточном расположении вирусов. Окружая вирио-
ны, они препятствуют их адсорбции на клетке.
Гуморальное звено защиты формирует приобретенный (постинфекцион-
ный) иммунитет за счет клонов клеток памяти из В-лимфоцитов.
Развитие вирусной инфекции всегда подавляет некоторые защитные меха-
низмы (незавершенность фагоцитоза, подавление синтеза молекул MHC I
класса на поверхности зараженных клеток, подавление активации компле-
мента по классическому и альтернативному пути и т.д.).
6
Практическая работа
1. Вирусологический метод диагностики (продолжение).
а) индикация и идентификация вируса гриппа в аллантоисной жидкости
куриного эмбриона.
II этап исследования: вскрытие куриных эмбрионов, взятие вируссодер-
жащей аллантоисной жидкости.
Скорлупу над воздушной камерой дезинфицируют, стерильными ножни-
цами срезают ее на 2-3 мм выше границы воздушной камеры. Через прокол в хорионаллантоисной оболочке стерильной пастеровской пипеткой набирают вируссодержащую аллантоисную жидкость в количестве 3-4 мл в стерильную пробирку. Индикацию вируса гриппа в аллантоисной жидкости проводят в ре-
акции гемагглютинации (РГА) (таблица 3).
Таблица 3 – Индикация и определение титра вируса гриппа в РГА
Разведения |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Контроль |
|
вируса |
1/10 |
1/20 |
1/40 |
1/80 |
1/160 |
1/320 |
|
|||||||||||
|
эритроцитов |
|||||||||||||||||
Ингредиенты |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Физиологический |
- |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
0,5 |
||||||||||
раствор (мл) |
|
|
||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Вируссодержащая |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
аллантоисная |
жид- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
кость (мл) |
|
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
в дез. р-р |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,5 |
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1% куриные эритро- |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
0,5 |
||||||||||
циты (мл) |
|
|
||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Учет реакции |
через |
++++ |
++++ |
++++ |
++++ |
++++ |
- |
|
- |
|||||||||
30 минут |
|
|
||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Затем проводят идентификацию вируса гриппа в РТГА (таблица 4).
7
Таблица 4 – Идентификация вируса гриппа в РТГА
Разведения |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Конт- |
Контр |
|
сывороток |
1/10 |
1/20 |
1/40 |
1/80 |
1/160 |
1/320 |
|
роль |
эрит- |
||||||||||
|
|
|
сыво- |
роци- |
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Ингредиенты |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ротки |
тов |
|
Физ. раствор (мл) |
- |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
|
- |
0,5 |
||||||||||
Гриппозные |
ди- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
агностические |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
сыворотки |
(мл) |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
|
0,5 |
|
|||||||||
А(H1N1), |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
A(H3N2), B |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
в дез. р-р |
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,25 |
|
|
|
||
Вируссодержащая |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
|
- |
- |
||||||||||
жидкость (мл) |
|
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Контакт 30-40 минут при комнатной температуре
1% куриные 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
эритроциты (мл)
Как видно из таблицы 4, вначале наливают по 0,25 мл физ. раствора во 2, 3, 4, 5 и 6 лунки полистироловой пластины, а в 8-ю лунку – 0,5 мл. Затем готовят двукратные разведения типовых гриппозных диагностических сывороток до разведения 1/320. К этим разведениям добавляют вируссодержащую жидкость в объеме 0,25 мл и смеси оставляют для контакта на 30-40 минут при комнатной температуре. После этого во все лунки вносят по 0,5мл 1% взвеси куриных эритроцитов.
Контроли реакции: контроль сыворотки (0,5мл сыворотки + 0,5мл эритроцитов) и контроль эритроцитов (0,5мл физ. раствора + 0,5мл эритроцитов).
Учет реакции через 1-2 часа (таблица 5).
Таблица 5 – Схема учета РТГА
Разведения |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
сывороток |
|
|
|
|
|
|
Контр. |
Контр. |
|
|
|
|
|
|
|
|
эрит- |
||
|
1/10 |
1/20 |
1/40 |
1/80 |
1/160 |
1/320 |
сыво- |
||
Гриппозные |
роци- |
||||||||
|
|
|
|
|
|
ротки |
|||
диагностичес- |
|
|
|
|
|
|
тов |
||
|
|
|
|
|
|
|
|||
кие сыворотки |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
A(H1N1) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
A(H3N2) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
B |
|
|
|
|
|
|
|
|
Заключение о типе вируса сделайте самостоятельно.
б) индикация и индентификация вирусов, культивируемых в культуре клеток Нер-2.
8