vse_metody_MIKROB

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Выделение чистой культуры аэробов.

I этап исследования. Посев смеси бактерий (S.aureus+E.coli) на пластин-

чатый МПА в чашке Петри петлей секторами.

Этапы посева:

а) на дне чашки Петри с МПА карандашом по стеклу сделать надпись: но-

мер стола, номер группы, факультет;

б) прокалить петлю, над спиртовкой открыть пробирку, обжечь ее края,

внести петлю в пробирку и остудить ее о стенки пробирки. Забрать пет-

лей исследуемый материал. Закрыть пробирку над спиртовкой и поста-

вить в штатив;

в) взять чашку Петри, приоткрыть крышку и нанести петлей секторами ис-

следуемый материал на МПА, закрыть чашку, прожечь петлю;

г) посевы поставить в термостат при температуре 37°С на 24 часа.

15

Занятие №6

Тема. Рост и размножение бактерий. Выделение чистой культуры аэробов.

Влияние физических и химических факторов на микроорганизмы. Методы сте-

рилизации. Дезинфекция. Асептика. Антисептика.

Цель занятия. Изучить рост и размножение бактерий, действие физических и химических факторов на микроорганизмы, методы стерилизации, дезинфекции и антисептики. Освоить второй этап бактериологического исследования по выделению чистой культуры аэробов.

I.Теоретические знания:

1.Рост и размножение бактерий.

2.Характеристика роста бактериальной популяции на плотных и жидких пита-

тельных средах.

3.Фазы развития бактериальной популяции в жидкой питательной среде.

4.Влияние факторов окружающей среды на микроорганизмы.

5.Виды дезинфекции. Химические вещества, используемые для дезинфекции.

6.Асептика. Антисептика. Химические вещества, используемые для антисептики.

II.Практические навыки и знания:

1.Проведение II этапа бактериологического метода исследования по выделе-

нию чистой культуры аэробов.

2.Действия медицинского работника при аварийных ситуациях (угроза зара-

жения ВИЧ).

1

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1. Рост и размножение бактерий.

Рост бактерий – это увеличение линейных размеров и массы микробной

клетки.

Размножение бактерий – это увеличение количества особей в популяции за счет поперечного деления, реже путем почкования.

Интервал времени, за который число клеток удваивается, называется време-

нем генерации (Т-генерации). Для большинства бактерий время генерации со-

ставляет 20-30 мин., у возбудителя туберкулеза – 24 часа.

Популяция бактерий – совокупность особей одного вида, сформировавшаяся в определенных условиях внешней среды.

2. Характеристика роста бактериальной популяции на плотных и жидких

питательных средах.

Популяция бактерий, развившаяся из одной микробной клетки на плотной питательной среде, называется колонией.

Культура бактерий – популяция одного вида микроорганизмов.

Для учета количества жизнеспособных клеток в культуре определяют число

колониеобразующих единиц в 1 мл материала (КОЕ/мл).

Колонии характеризуют по следующим признакам:

1)по размеру: мелкие - 1-2 мм; средние - 2-4 мм; крупные - более 4 мм;

2)по форме: круглые или неправильной формы;

3)по рельефу: выпуклые, уплощенные;

4)по характеру поверхности: гладкие или шероховатые;

5)по характеру краев: ровные, изрезанные, волнистые;

6)по оптическим свойствам: прозрачные, полупрозрачные, непрозрачные;

7)по цвету: бесцветные или пигментированные (золотистые, красные, сине-

зеленого цвета и др.);

8)по запаху, например, колонии синегнойной палочки имеют запах жасми-

2

на, фиалки, карамели;

9) по консистенции: сухие, влажные, слизистые.

Гладкие колонии с ровными краями обозначаются как «S»-колонии (англ. smooth – гладкие), шероховатые с изрезанными краями - «R»-колонии (англ. rough – шероховатые). Внешний вид колоний у некоторых бактерий настолько характерен, что может служить одним из дифференциальных признаков при их идентификации. Например, R-колонии возбудителя чумы (Yersinia pestis) срав-

нивают с «кружевными платочками», т.к. они имеют плотный центр и прозрач-

ные волнистые края, R-колонии возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis)

напоминают «гриву льва».

Характер роста микроорганизмов в жидкой питательной среде зависит от

скорости деления и типа дыхания бактерий и может быть:

1)диффузно-мутящий (Staphylococcus aureus, Escherichia coli);

2)придонный или придонно-пристеночный (Streptococcus pyogenes);

3)поверхностно-пленчатый (Vibrio choleraе, Mycobacterium tuberculosis).

3

Рост микроорганизмов в жидкой питательной среде.

Некоторые виды возбудителей дают характерный тип роста в жидкой пита-

тельной среде. Например, Y.pestis образует на поверхности пленку со спускаю-

щимися вниз тяжами (нитями) - «чумные сталактиты»; B.anthracis образует придонный осадок в виде «комочка ваты».

3. Фазы развития бактериальной популяции в жидкой питательной среде.

I – лаг-фаза (от англ lag – отставать) – начальная фаза от момента посева бактерий до начала размножения. Бактерии адаптируются к новым условиям обитания.

II – экспоненциальная (логарифмическая) фаза. Характеризуется макси-

мальной скоростью деления клеток, которая зависит от вида бактерий.

III – стационарная фаза. Характеризуется равновесием между количеством погибающих и вновь образующихся клеток. В эту фазу количество живых бак-

терий в популяции достигает максимальной концентрации.

4

IV – фаза отмирания. Характеризуется гибелью бактерий вследствие исто-

щения питательной среды и других факторов.

Непрерывное культивирование с накоплением бактериальной массы ис-

пользуется в биотехнологических процессах и на микробиологических произ-

водствах (получение бактерийных препаратов).

Фазы развития бактериальной популяции

вжидкой питательной среде

4.Влияние факторов окружающей среды на микроорганизмы.

Физические, химические и биологические факторы окружающей среды оказывают различное воздействие на микроорганизмы: бактерицидное – при-

водящее к гибели клеток; бактериостатическое – подавляющее размножение;

мутагенное – изменяющее наследственные свойства бактерий.

Влияние физических факторов на микроорганизмы.

Методы стерилизации. Аппаратура.

1. Ультразвук. Под его действием в цитоплазме бактерий образуются ка-

витационные полости, заполненные парами жидкости под высоким давлением до 10 000 атм. Это приводит к разрушению цитоплазматических и оболочечных структур клетки. Практическое применение: для стерилизации вакцин, жид-

ких пищевых продуктов и др.

5

2. Ультрафиолетовый свет – повреждает ДНК микробной клетки. Дейст-

вие УФ-света на бактерии было доказано опытом Бухнера: в чашку Петри с МПА делают посев культуры микроорганизмов, например, S.typhi «сплошным газоном». На посев накладывают черную бумагу с вырезанными буквами, со-

ставляющими какое-либо слово, например, «typhus» и подвергают его дейст-

вию прямых солнечных лучей в течение 1 часа. После этого черную бумагу снимают и ставят чашку на сутки в термостат при температуре 370С. Рост куль-

туры микробов наблюдается только на тех участках среды, которые были за-

щищены от действия УФ-лучей. Практическое применение УФ-лучей: сте-

рилизация воздуха в операционных, родильных залах, палатах для новорож-

денных, в бактериологических лабораториях и др.

Опыт Бухнера с культурой S.typhi

3. Гамма-излучение вызывает повреждение белков и нуклеиновых кислот мик-

робной клетки (микробицидное действие). Практическое применение: для стерили-

зации одноразовых шприцев, одноразовой пластиковой микробиологической посуды,

перевязочного материала, систем для переливания крови.

4. Высокая температура – вызывает денатурацию белков и инактивацию ферментов микроорганизмов. Практическое применение: для стерилизации

различных объектов.

Стерилизация или обеспложивание (лат. sterilis - бесплодный) – полное уничтожение всех микроорганизмов и их спор в различных объектах (хирурги-

ческие инструменты, перевязочный материал, питательные среды и др.).

6

Методы стерилизации:

I. Физический:

1. Прокаливание в пламени спиртовки. Этот способ имеет ограниченное применение, в частности, для стерилизации бактериологических петель.

2. Сухим жаром в печи Пастера (воздушный стерилизатор). Режим сте-

рилизации: 180°С, 1 час. Стерилизуют стеклянную посуду (чашки Петри, пи-

петки, пробирки), хирургические инструменты.

3. Паром под давлением в автоклаве.

Параметры автоклавирования выбирают в зависимости от свойств мате-

риала. Чаще используют следующие режимы: 1 атм (1210С), 1,5 атм (1250С),

7

2 атм (1340С). При таких режимах вегетативные формы микробов погибают в течение нескольких минут, а споры за 20-30 минут.

Способ автоклавирования основан на том, что образующийся при кипении воды пар не выходит наружу, а, скапливаясь в замкнутом пространстве, повы-

шает давление. Соответственно давлению увеличивается и температура кипе-

ния воды. Тепло, генерируемое при повышении давления, называется латент-

ным теплом, оно имеет большую проникающую способность, разрушающую структуру микроорганизмов и спор.

4. Стерилизация УФ-облучением. Применяется для стерилизации возду-

ха в микробиологических лабораториях, родильных залах, палатах для новоро-

жденных, операционных, процедурных кабинетах и др. Ее проводят ультра-

фиолетовыми бактерицидными лампами различной мощности.

8

II. Химический метод стерилизации основан на использовании токсичных газов: оксида этилена, формальдегида и др. Эти вещества инактивируют фер-

менты и нуклеиновые кислоты микроорганизмов. Химическая стерилизация проводится в специальных камерах при температуре газа от 20 до 600С. Прак-

тическое применение: стерилизация оптических приборов, предметов меди-

цинского назначения из полимерных материалов.

III. Механический метод стерилизации (фильтрование) основан на меха-

нической задержке микроорганизмов и их спор мелкопористыми фильтрами с определенным диаметром пор. В микробиологической промышленности и в ла-

бораторной практике широко применяется фильтрация материала через асбе-

стовые и нитроцеллюлозные фильтры. Фильтрование используют для стерили-

зации биологических препаратов, не выдерживающих нагревания (сывороточ-

ные препараты, антибиотики, бактериальные экзотоксины и др.).

5. Виды дезинфекции. Химические вещества, используемые для де-

зинфекции.

Дезинфекция (от франц. приставки des и лат. infectio – заражение) – это комплекс мероприятий, направленных на уничтожение и удаление возбудите-

лей инфекции из объектов окружающей среды. Дезинфекция отличается от сте-

рилизации по конечному результату. Путем стерилизации уничтожаются все виды микроорганизмов и их споровые формы. При дезинфекции погибают

только вегетативные формы болезнетворных микроорганизмов.

Для проведения дезинфекции обычно используют химические дезинфици-

рующие средства. Выбор дезинфицирующего средства, а также способ его применения определяются особенностями обеззараживаемого объекта и биоло-

гическими свойствами материала.

Различают профилактическую, текущую и заключительную дезинфек-

цию.

9