4.4. Обращенно-фазовая система сорбат – элюент – сорбент

Для условий ОФХ оставим фенолы в качестве модельных соединений для изучения параметров удерживания. Установлено [27], что порядок удерживания фенолов возрастает по мере увеличения их гидрофобности (увеличения объема и числа алкильных и арилалкильных заместителей и уменьшения числа гидроксилов и других полярных групп), а также по мере увеличения полярности ПФ (уменьшении элюирующей силы при уменьшении концентрации ацетонитрила или метанола). В чистом модификаторе V_R низших фенолов стремятся к мертвому объему V_м. С повышением полярности ПФ V_R многоатомных и низших фенолов медленно возрастают, V_R гидрофобных фенолов, напротив, быстро растут. Растворимость последних в элюентах, содержащих воду, резко ухудшается, в связи с чем измерение параметров удерживания гидрофобных фенолов (H>10) при φ₂<0.75 затруднительно. Предварительные опыты показали, что возможно хроматографирование таких фенолов элюентами, нагретыми до 40-50С. Общий негативный фактор – уширение пиков фенолов при увеличении полярности ПФ. Для устранения этого явления в ПФ необходимо добавлять небольшие количества уксусной или фосфорной кислоты, подавляющих диссоциацию фенолов и улучшающих форму пика.

Между параметрами удерживания фенолов и полярностью ПФ, выраженной в P^o и P_N , найдены линейные корреляции [27]:

logV_R=a+bP^o и logV_R=a+bP_N (103)

Коэффициенты a и b этих уравнений в свою очередь тесно коррелируют с величиной гидрофобности H. Коэффициент a уменьшается, а коэффициент b возрастает. Такой компенсационный эффект указывает на общность механизма удерживания в рассматриваемом ряду соединений и на то, что решающие факторы удерживания – объем молекул сорбатов, их полярные свойства (дипольный момент и поляризуемость) удовлетворительно характеризуются критерием гидрофобности Н. Поэтому между удерживанием и критерием Н также существуют прямые корреляции. Расположение линий трендов logV_r =f(H) и logV_r =f(P^o) веерообразно (рис.72 и 73), что характерно для зависимостей «удерживание – структура» и «удерживание – состав ПФ» в обращенно-фазовой ВЭЖХ[27].

Вместе с тем, заметный разброс экспериментальных зависимостей параметров удерживания от величины гидрофобности сорбата [27] говорит о том, что на удерживание фенолов оказывает влияние не только общие размеры молекулы и число функциональных групп, но и более тонкие структурные различия, а так же, как будет показано ниже, остаточная силанольная активность сорбента.

Рис.72. Полулогарифмические анаморфозы logV_R - Р° в хроматографической системе с НФ Силасорб С₁₈ и ПФ ацетонитрил – вода для сорбатов: 1 ‒ 3-(трет-бутилфенил)-1-(2-гидроксифенил)пропан-1-он;; 2 – п-трет-бутилфенол; 3 – 2-нафтол; 4 – фенол; 5 – гидрохинон

Установлено, что пара-изомеры вымываются несколько быстрее, чем мета- и орто-изомеры. Фенолы симметричного строения вымывается быстрее, чем несимметричные, при этом расположение алкильных заместителей в фенолах решающего влияния на удерживание не оказывает, как это имеет место в нормально-фазовой ВЭЖХ. Например, наличие внутримолекулярных водородных связей для орто-замещенных фенолов не приводит к существенному изменению параметров удерживания и, по-видимому, только немного уменьшает их гидрофильность.

Сопоставление данных об удерживании фенола (реперное вещество) из каталогов ведущих фирм-поставщиков хроматографических колонок (Alltech, Bio-Rad, Supelco, Waters), в которых размещены хроматограммы фенолов, полученные по типовым оптимизированным методикам на стандартных обращенно-фазовых колонках, показало, что при временах удерживания фенола, близких к 3 мин, составы ПФ содержат 40-65% ацетонитрила, что соответствует диапазону Р^о=0.64-0.78. На микроколонках такое удерживание наблюдается при 35-45% ацетонитрила (Р^о=0.75-0.80). Для сравнения, стандартные метанольные ПФ при ВЭЖХ фенолсодержащих проб содержат 35-45% модификатора (Р=0.79-0.84), т.е. оптимальные ацетонитрильные ПФ для микроколоночной ВЭЖХ изоэлюотропны метанольным ПФ для обычной ВЭЖХ. Отсюда можно заключить, что при переходе от стандартной колонки к микроколонке следует на 5-15% повышать полярность ПФ (уменьшать элюирующую силу) для получения аналогичных параметров удерживания фенолов.

Рис.73. Полулогарифмические анаморфозы logV_R –Н в ПФ ацетонитрил – вода с φ₂ = 0.5 (1); 0.75 (2); 0.8 (3); 1.0 (4).

Таким образом, обнаруженная тенденция смещения диапазона оптимальной полярности ПФ в сторону уменьшения элюирующей силы может быть отнесена к особенностям микроколоночной ВЭЖХ. Точно такая же тенденция нами замечена и для нормально-фазовой микроколоночной ВЭЖХ.

Что касается гидрофобных сорбатов, в том числе фенольного типа, их хроматографирование следует проводить в ПФ с максимально высоким содержанием модификатора, как в обычном, так и в микроколоночном варианте обращенно-фазовой ВЭЖХ. При совместном разделении низших и высших фенолов изократическое элюирование нецелесообразно. Разумным компромиссом является применение градиента с повышением объемной доли модификатора от минимально возможной (по условию растворимости в ПФ) до 100%. Одновременно с этим рационально повышение температуры термостатирования колонки, что в настоящее время реализуют на приборах ВЭЖХ с термостатом колонок.

В работе [48] проанализированы зависимости параметров удерживания фенолов от их строения и от состава ПФ ацетонитрил – вода в условиях микроколоночной ВЭЖХ на аминопропильном силикагеле. Характер сорбции фенолов в условиях НФХ на аминопропильной фазе мало отличается от наблюдаемых тенденций для НФХ на немодифицированном силикагеле. В сорбционных взаимодействиях, важнейшим из которых является образование Н-связей, принимают участие и аминогруппы, и остаточные силанольные группы. Отмечается, что аминопропильные силикагели удерживают полярные вещества слабее, чем немодифицированный силикагель, а хроматографическое поведение алкилфенолов и нафтолов подчиняется простым моделям Снайдера – Сочевинского [48]. Обращенно-фазовая ВЭЖХ на аминопропильном силикагеле для фенолов априори не оптимальна, так как удерживание осуществляется по смешанному механизму. При этом для нормально-фазовой распределительной ВЭЖХ фенолов ПФ слишком полярна, а для ОФХ ‒ длина алкильного линкера (С₃) на поверхности сорбента слишком коротка, чтобы эффективно удерживать гидрофобные фрагменты сорбата. В связи с этим исследователи старались избегать изучения удерживания фенолов в этой системе. Вместе с тем, фенольные соединения могут присутствовать в пробах, содержащих полиолы, углеводы, для разделения которых часто используют именно ОФХ на аминофазе, а значит, необходимо учитывать в этих случаях хроматографическое поведение фенолов. Во-вторых, изучение экстремальных условий ВЭЖХ позволяет лучше понять закономерности удерживания, протекающие в типовых условиях. Наконец, в хроматографической практике появились обращенно-фазовые сорбенты, у которых между силикагелем и привитой гидрофобной группой (С₁₈-, С₈-, Ph- и др.) находится относительно полярный фрагмент (специальная полярная вставка), а кроме этого остаточные силанольные группы «эндкеппированы» (от англ. end capping ‒ окончательное покрытие поверхности силикагеля) не триметилхлорсиланом для подавления силанольной активности, а соединениями, придающими поверхности сорбента гидрофильные свойства. К такому смешанному типу можно отнести сорбенты Synergy Hydro-RP и Synergy Polar-RP (изготовитель Феноменекс, США) и др. Обращенно-фазовые хроматографические системы с подобными сорбентами обладают повышенной гидрофильной селективностью, сохраняя при этом и метиленовую (гидрофобную) селективность.

Рис. 74. Зависимость V_R от объемной доли ацетонитрила в системе с неподвижной фазой Силасорб NH₂ и подвижной фазой вода – ацетонитрил для сорбатов: 1 – 2-нафтол; 2 – фенол; 3 – м -крезол; 4 – бензол; 5 – (2-гидрокифенил)-(п-толил)метанон

Эти сорбенты нашли применение в разделении стероидов, пестицидов, афлатоксинов, органических кислот. Наличие и гидрофобных, и гидрофильных функциональных групп на поверхности сорбента вносит элемент непредсказуемости в порядок удерживания полифункциональных сорбатов.

. Аминопропильный силикагель можно рассматривать как один из упрощенных вариантов сорбента со смешанными свойствами. В свою очередь фенолы являются сорбатами с хорошо изученным поведением в типовых вариантах ВЭЖХ, а значит, удобными объектами исследования.

На рис. 74 приведена выборка из наблюдаемых зависимостей V_R=f(₂) некоторых фенолов разного строения в ПФ вода – ацетонитрил на Силасорбе NH₂ (80×2 мм). Величина мертвого объема колонки составляла V_m = 190 мкл, ее определили по удерживанию нитрита натрия.

Первое, что бросается в глаза при анализе полученных данных, это наличие минимумов в зависимостях V_R=f(₂) в области ₂, близкой к 0.7. На качественном уровне такое хроматографическое поведение можно объяснить конкуренцией между распределительным и сольвофобным механизмами удерживания. В распределительном варианте сорбции ацетонитрил следует рассматривать как разбавитель, а воду – как полярный модификатор с большей, чем у ацетонитрила элюирующей силой, который способствует десорбции фенолов из адсорбционного слоя у поверхности сорбента. С другой стороны, увеличение концентрации воды в элюенте приводит к усилению сольвофобного эффекта. Гидрофобные фрагменты фенолов из полярной среды элюента вытесняются к менее полярной аминопропильной щетке, модифицирующей поверхность сорбента. С увеличением объемной доли ацетонитрила вклад распределительного механизма сорбции в величину V_R возрастает, а вклад сольвофобной составляющей, напротив, падает. Таким образом, результирующее значение V_R можно представить в виде суммы вкладов.

V_R =(1-х)V_NP+хV_RP, (104)

где V_NP – составляющая объема удерживания, обусловленная нормально-фазовым распределительным механизмом сорбции, V_RP – составляющая объема удерживания, обусловленная сольвофобным механизмом сорбции, х ‒ коэффициент, зависящий от свойств системы сорбат – элюент – сорбент.

Выше показано, что в условиях нормально-фазовой ВЭЖХ объемы удерживания фенолов можно адекватно описать уравнением инверсии 2-го порядка типа (98). При этом свободный член уравнения можно принять за мертвый объем V_М. В обращенно-фазовой ВЭЖХ в чистом ацетонитриле на октадецилированном силикагеле (Силасорбе С₁₈) V_R низших фенолов стремятся к мертвому объему V_м. С повышением полярности ПФ величина V_R низших фенолов возрастает медленно, а гидрофобных фенолов, напротив, очень быстро. Для удовлетворительного описания зависимости V_R от полярности элюента в условиях НФХ и ОФХ пригодны зависимости (98 и 103).

Приняв выражения (98) и (103) в качестве частных функций, описывающих изменения V_NP и V_RP при увеличении полярности ПФ, обобщенную функцию, характеризующую результат влияния двух механизмов сорбции на суммарный объем V_R, запишем в следующем виде.

V_R = (1-х)(V_М + a/P + b/P²)+х10^(c+dP) (105)

где х – эмпирический коэффициент, учитывающий вклад двух трендов в наблюдаемый объем удерживания, Р – обобщенный критерий Р^о или Р_N. При х=0 уравнение (105) вырождается в уравнение (98), т.е. объем удерживания описывается зависимостями, характерными для распределительной сорбции. При х=1 уравнение (105) преобразуется в уравнение (103). Компьютерная оптимизация показала, что эмпирический коэффициент с можно успешно заменить значением lоgV_м, уменьшив тем самым число эмпирических коэффициентов. Следовательно, уравнение (103) в рассматриваемой хроматографической системе можно представить как

lоgV_R = lоgV_м + dP, (106)

В конечном итоге, уравнение (104) преобразуется в уравнение (106).

(107)

Уравнение (107) адекватно описывает эксперимент [46]. Таким образом, уравнение (107) позволяет оценить соотношение величин V_NP и V_RP при разных составах ПФ ацетонитрил – вода (рис. 75). Оказалось, что в чистом ацетонитриле доля V_RP для фенолов составляет только 0.03-8.8% от наблюдаемого суммарного V_R. При увеличении содержания воды в ПФ до 60%, доля обращенно-фазовой составляющей V_RP возрастает до 30-40%. Тесных корреляций между величиной V_RP и параметрами, характеризующими строение фенолов (радиус гирации молекулы R_G, критерий Н, logP, дипольный момент μ) найти не удалось. Наблюдается тенденция уменьшения V_RP с ростом μ (рис. 76). Это можно объяснить тем, что высокий дипольный момент способствует удерживанию по нормально-фазовому механизму.

Рис. 75. Обобщенная функция (103) и частные функции V_NP=f(P^о) и V_RP=f(P^о) для ВЭЖХ о-крезола в ПФ вода-ацетонитрил, НФ - Cиласорб NH₂

Рис. 76. Линейная корреляция между μ сорбата и обращенно-фазовой составляющей V_RР =46.5-5.9μ в ПФ вода – ацетонитрил (₂=0.4): 1 – бензол; 2 – 2-нафтол; 3 – о-крезол; 4 – п-трет-бутилфенол; 5 – п-крезол; 6 – фенол; 7 – эвгенол; 8 – м-крезол, 9 – (2-гидрокифенил)-(п-толил)метанон

В целом, отмечаемая картина говорит о большой сложности взаимодействий и процессов, происходящих в выбранной хроматографической системе сорбат – сорбент – элюент, которые удается адекватно охарактеризовать лишь феноменологическими моделями. В выбранном наборе соединений четко просматривается только отличие хроматографических свойств бензола от свойств фенолов. Отсутствие группы -ОН в бензоле исключает образование Н-связей с полярными группами силикагеля и водой в адсорбционном слое. Поэтому для него характерна повышенная доля V_RP (25 – 53%) во всем изученном диапазоне полярности ПФ.

Такие структурные факторы, как сравнительно небольшие размеры молекулы и отсутствие полярной группы, позволяют реализовать сольвофобное удерживание бензола даже короткими аминопропильными линкерами. Удерживание фенолов только немного уменьшается по мере увеличения их гидрофобности.

Линейные корреляции V_R от H фенолов типа logV_r=а+bH, пример которых приведен на рис. 69, столь характерные для обращенно-фазовой ВЭЖХ на С₁₈, не наблюдаются. Более или менее ясные тенденции просматриваются при ₂ = 0.7-0.9 в области близкой к минимуму на кривых V_R = f(Р^о), но эти тенденция описывается уравнением обратной инверсии третьего порядка (102), то есть соответствуют НФХ (рис.77).

Рис. 77. Связь между logP и удерживанием фенолов в ПФ вода – ацетонитрил (₂=0.7) на Силасорбе NH₂

Таким образом, величина V_R фенолов в обращенной ПФ на аминофазе в первую очередь определяется нормально-фазовым распределительным механизмом удерживания и только при большом содержании воды, сопоставимом с объемной долей ацетонитрила, сольвофобный механизм удерживания начинает вносить существенный вклад в величину наблюдаемого V_R (табл. 63). Можно согласиться с мнением, что с точки зрения теории адсорбции из многокомпонентных растворов, разделение ВЭЖХ на нормально- и обращенно-фазовый варианты условно. Оба варианта надо рассматривать с единых позиций.

Выведенные феноменологические зависимости типа (107), по всей видимости, позволяют оценить остаточную силанольную активность модифицированных силикагелей. При этом она по-разному проявляет себя, в зависимости от состава элюента, строения сорбата и типа, а возможно, и партии сорбента. Так, взяв для расчета коэффициентов уравнения (107) экспериментальные данные V_M и V_R из работы [27], мы получили интересную информацию о характере удерживания фенолов в серии ПФ ацетонитрил – вода на микроколонке, заполненной сорбентом Силасорб С₁₈ (табл. 64 и 65). Потребовалось единственное дополнительное ограничение, вводимое при нахождении эмпирических коэффициентов – при их оптимизации необходимо соблюдать условие

V_М +a/P+b/P²≥0.

В противном случае, как одно из возможных формальных решений, могут получаться отрицательные значения V_NP, не имеющие физического смысла. Оказалось, что зависимости (107) описывают эксперимент в ОФХ (табл. 64) лучше, чем зависимости (103).

Таблица 65. Величина V_RP (%) для фенолов в системе ацетонитрил – вода – микроколонка Силасорб NH₂. Скорость потока 100 мкл/мин

Соединение	Объемная доля ацетонитрила в элюенте, φ2
	1	0.9	0.8	0.7		0.5	0.4
Фенол	0.1	0.2	0.7	2.2	17.4		38.5
о-Крезол	8.6	11.9	15.7	20.1	30.3		36.0
n-Крезол	7.5	11.0	15.4	20.6	33.2		40.2
м-Крезол	3.3	5.2	8.0	11.8	23.2		30.8
Эвгенол	0.03	0.1	0.4	1.4	14.1		35.4
2-Нафтол	0.5	1.1	2.5	5.3	20.4		34.9
п-трет-Бутилфенол	0.4	1.0	2.3	4.9	20.0		35.1
Бензол	24.9	30.6	36.1	41.0	49.6		53.4
(2-гидрокифенил)-(п-толил)метанон	8.8	11.8	15.1	18.8	27.3		32.0
Ионол	0.8	1.8	3.7	7.4	24.8		39.9

Таблица 66. Относительная величина V_RP (%) для фенолов в системе ацетонитрил – вода – Силасорб С₁₈ (микроколонка колонка 64×2 мм, зернение 5 мкм)

Соединение	Объемная доля ацетонитрила в элюенте, φ2
	1	0.9	0.8	0.7	0.5	0.4
Гидрохинон	62.5	64.4	66.2	67.9	70.9	72.4
Пирокатехин	90.3	95.5	98.5	99.7	99.9	99.5
Фенол	90.7	95.7	98.5	99.6	99.7	99.3
о-Крезол	80.9	88.6	94.0	97.0	99.0	99.1
n-Крезол	80.6	89.3	95.5	98.8	100.0	100.0
м-Крезол	78.1	85.6	91.0	94.2	96.8	97.1
Эвгенол	82.8	91.6	96.9	99.2	99.9	99.7
2-Нафтол	85.6	92.0	97.3	99.6	100	100
п-трет-Бутилфенол	79.3	88.7	94.6	97.6	99.3	99.5

Найдено, что в чистом ацетонитриле в объем удерживания фенолов 10-20% вносит свой вклад V_NP, который при добавлении воды в элюент быстро сводится на нет (табл. 67). Из этого следует, что хроматографическое поведение всех рассмотренных фенолов на октадецилированном силикагеле только в первом приближении подчиняется обращенно-фазовому характеру удерживания.

При высоких концентрациях ацетонитрила становится заметна конкуренция с распределительным механизмом. А для гидрохинона его влияние прослеживается во всем диапазоне составов ПФ (V_NP =37.5–27.6%). Это можно объяснить симметричным пара-положением гидроксилов в молекуле гидрохинона, которое мешает реализации сольвофобного вытеснения последней из объема элюента в гидрофобную зону октадецилированной поверхности сорбента и одновременно способствует гидрофильным взаимодействиям с немодифицированными участками адсорбционного слоя.

Таблица 67. Величина нормально-фазовой составляющей V_NP (мкл) при φ₂=1 в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ в системе ацетонитрил – Силасорб с₁₈

Соединение	По данным [27]		Расчет по (107)
	Коэффициент а уравнения (103)	VNP	logVNP	VNP
гидрохинон	2.01	102	1.99	98
фенол	1.92	83	1.32	21
o-крезол	1.70	50	1.71	51
n-крезол	1.69	49	1.70	50
м-крезол	1.77	59	1.73	54
4-аллил-3-метоксифенол	1.54	35	1.60	40
Ионол	0.62	4	-	-
3-(бисфенил-4-ил)-1-(2-гидроксифенил)пропан-1-он	0.14	1	-	-

Если сопоставить экспериментальные значения свободного члена уравнения (102) с расчетами по выражению (107), становится очевидным его физический смысл (табл. 67). Он оказался близок значению V_NP в чистом ацетонитриле, т.е. характеризует наличие нормально-фазового удерживания при φ₂=1. Следовательно, уравнение (103), описывающее поведение фенолов в условиях ОФХ можно записать в виде

lоgV_R = lоgV_NP + dP^о (109)

Этому предположению не противоречат очень низкие значения коэффициента а в (103) для высокогидрофобных соединений фенольного типа с гидроксильными группами, стерически (или за счет образования внутримолекулярных Н-связей) экранированными орто-заместителями. Чем меньше коэффициент а, тем меньше соединение способно удерживаться за счет участия в сорбционных процессах полярных групп, чем выше гидрофобность вещества, тем сильнее сольвофобный эффект. Конечно, не все данные работы [27] так хорошо совпали с расчетами по (103), но это говорит лишь о том, что для проверки выдвинутой идеи требуется дополнительный статистический анализ более широкого массива экспериментальных данных как по структурному разнообразию сорбатов, так и по диапазону составов ПФ. Вместе с тем, наши результаты качественно согласуются с выводами, что в условиях ОФХ вклад специфических и неспецифических взаимодействий молекул фенолов с молекулами ПФ в объеме и в адсорбционном слое зачастую соизмерим с вкладом неспецифических взаимодействий молекул сорбата с гидрофобной поверхностью сорбента. В результате чего зависимость объема удерживания сорбатов в случае ВЭЖХ с применением водно-ацетонитрильной ПФ и аминопропильного силикагеля в широком диапазоне изменения полярности ПФ подчиняется феноменологической модели, характерной для НФХ.