2.5. Элюирующая сила

Понятие об элюотропных рядах ввел в 1940 г. Траппе [12]. В элюотропном ряду растворители расположены в порядке увеличения элюирующей силы. Последовательность растворителей изменяется в зависимости от того, на каких сорбентах определяется их элюирующая способность. В условиях НФХ более полярные растворители обладают пропорционально большей элюирующей силой. В ОФХ, наоборот, вода обладает низкой элюирующей силой, а элюирующая сила элюента обратно пропорциональна полярности органического модификатора. В настоящее время имеются надежные элюотропные ряды чистых растворителей для всех основных сорбентов. Нет еще полной ясности с точным определением элюирующей способности смесей растворителей, не смотря на то, что составлено большое количество элюотропных рядов для бинарных смесей. Влияние состава смешанного растворителя на его элюирующую силу в целом носит сложный характер. Часто ее определяют при различной активности сорбентов. Сопоставление элюотропных рядов полученных таким образом неправомерно. Существует проблема «грязных» растворителей. Наличие примесей в растворителе может привести к заметному искажению элюирующей силы смешанной ПФ, приготовленной из такого растворителя. Это особенно характерно для воды. Содержание воды в ПФ и степень покрытия НФ водой являются очень важными параметрами в НФХ. Помимо значительного уменьшения времени удерживания, следствием добавления воды к ПФ может быть также улучшение формы пика, повышение эффективности колонки и улучшение воспроизводимости результатов.

2.5.1. Элюирующая сила в нормально-фазовой хроматографии

В связи с тем, что элюирующая сила определяется не только природой растворителей, но и механизмом разделения на разных сорбентах, рассмотрим отдельно ситуацию для НФХ на силикагеле. В общем случае элюирующая сила бинарных и многокомпонентных ПФ лежит в интервале соответствующих значений чистых компонентов. В тоже время элюирующая сила смешанного растворителя неаддитивно меняется в зависимости от объемной доли модификатора, особенно заметны отличия от аддитивности как раз в случае адсорбционной НФХ. Даже незначительное увеличение полярного модификатора приводит к первоначально резкому увеличению элюирующей силы, затем это увеличение изменяется более монотонно.

Рис. 33. Элюирующая сила бинарных ПФ гексан – модификатор на силикагеле: 1 – ИПС; 2 – диоксан; 3 – этилацетат; 4 – диэтиловый эфир; 5 – ТГФ [1]

Из рис. 33. видно, что изотермы ^о₁₂-₂ представляют собой кривые насыщения. При этом соблюдается тенденция – чем больше элюирующая сила модификатора, тем резче и выше скачок элюирующей способности при его добавлении к разбавителю, т.е. «насыщение» элюирующей силой происходит при добавлении меньших объемов модификатора в разбавитель.

Впервые зависимость элюирующей силы смеси растворителей от ее состава была изучена Снайдером. Им же было предложено уравнение для расчета элюирующей силы смеси двух растворителей по известным значениям силы каждого из них.

, (67)

где  - активность НФ, n₂ – площадь, необходимая для размещения молекулы модификатора на поверхности, а N₂ – мольная доля модификатора. Это уравнение демонстрирует связь элюирующей способности элюента с размерами молекул модификатора, конкурирующего с молекулой сорбата в хроматографическом процессе, а также с мольной долей модификатора и с хроматографическими свойствами сорбента.

Для тройной ПФ, пользуясь теоретическими выкладками Снайдера, в основе которых лежит представление о конкурентной адсорбции нескольких молекул на одних и тех же центрах однородной поверхности и некоторые упрощения (предполагается использовать среднюю площадь молекулы модификатора и считать ее примерно равной площади молекулы сорбата) можно вывести следующее уравнение

, (68)

где ^о₁₂₃ – элюирующая способность тернарной ПФ, ^о₂ и ^о₃ элюирующая способность наиболее полярных компонентов;  - активность НФ, n₂₃ – средняя площадь молекул компонентов, а N₂ и N₃– их мольные доли.

Уравнения (67) и (68) хорошо аппроксимируют экспериментальные значения суммарной ^о, если разбавитель и модификатор не слишком резко отличаются по полярности, если силикагель не слишком насыщен влагой. Наибольшие отклонения наблюдаются для систем неполярный разбавитель (гексан и т.п.) и полярный модификатор (спирты), особенно при низких концентрациях модификатора (<5% об.). Причиной этих искажений является эффект локализации растворителя. Согласно модели, предложенной Снайдером, ни для одного типа молекул разбавителя или модификатора не наблюдается преимущественной адсорбции на поверхности, а имеет место адсорбция этих молекул в монослое в соответствии со статистическим распределением. На самом деле, полярные молекулы модификатора локализуются на более "активных" центрах. Эти центры становятся менее доступными для обменных процессов с молекулами хроматографируемого вещества. В результате элюирующая способность оказывается выше, чем рассчитанная в соответствии с предположением о совершенно "равноправной" адсорбции растворителей. При концентрациях модификатора, превышающих 5%, эффекты локализации прекращаются. Соответственно, уменьшается и величина ошибки Δ^о₁₂. Применяя довольно сложную и трудоемкую процедуру [1,12-14], можно рассчитать правильные значения ^о₁₂ для любой бинарной смеси. Для каждой пары растворителей проводят два расчета. На практике значения ^о₂ зависят от концентрации модификатора, а не являются постоянными. Эти скорректированные величины ^о₂ следует подставлять в уравнении (67), причем расчеты проводятся для каждого соотношения двух растворителей. Среднюю величину n₂ в расчетах часто принимают равной 5. Эта величина мало влияет на полученные значения суммарной ^о. Расчеты истинных ^о для бинарных и многокомпонентных ПФ проводить «вручную» сложно, они включают итерационные стадии. Поэтому результаты расчетов по уравнениям типа (67) и (68) будут носить приблизительный характер.

Уравнение (67) при N₂>0.2 и (^о₂-^о₁)>0.2, преобразуется в более простое выражение (69), которое часто хорошо описывает экспериментальные данные.

log^о₁₂=log^о₂+(logN₂)/n₂ (69)

В то же время следует признать, что уравнением Снайдера пользоваться в рутинной работе не удобно. Достаточно сказать, что концентрация компонентов ПФ дозируется в объемных соотношениях, экспериментальные значения ^о₁₂, как показано выше, могут существенно отклоняться от рассчитанных по (67) из-за эффектов локализации полярного растворителя у поверхности сорбента.

Данные об элюирующей силе смесей нужны, прежде всего, для поиска изоэлюотропных составов ПФ. Изоэлюотропные подвижные фазы – ПФ, которые отличаются друг от друга качественным и количественным составом растворителей, но имеют одинаковую элюирующую силу в выбранной хроматографической системе. Концепция изоэлюотропных ПФ была разработана в связи с необходимостью быстрого прогноза, на какую смесь растворителей можно заменить испытанную ПФ, чтобы получить практически такую же элюирующую способность по отношению к одним компонентам анализируемой смеси, но бо;´льшую или ме;´ньшую по отношению к другим компонентам. Играя на различии специфических взаимодействий между сорбатами, сорбентом и ПФ удается в конечном счете оптимизировать разделение.

Можно выделить несколько причин, по которым возникает задача подбора изоэлюотропного состава: 1) изменить селективность хроматографической системы для увеличения разрешения, заменяя один сильный растворитель на другой, сохраняя элюирующую способность неизменной; 2) улучшить растворимость компонентов пробы в ПФ; 3) повысить чувствительность детектирования; 3) улучшить технико-эксплуатационные показатели методики разделения (уменьшить стоимость расходуемых материалов, понизить уровень их пожароопасных и токсикологических свойств и т.п.)

В настоящее время имеются общие правила, позволяющие подходить системно к решению вопроса оптимизации селективности [1,4,5,12-14]. Если использование чистых растворителей в соответствующей области значений T_R не приводит к успешному разделению соседних зон, то следует перейти к многокомпонентным смесям растворителей. Для разделения простых проб наиболее пригодны двухкомпонентные смеси растворителей. При анализе сложных проб могут понадобиться трех- и четырехкомпонентные смеси растворителей.

Таблица 51. Элюирующая сила ε₁₂ для бинарных ПФ гексан – модификатор

Модификатор	2	ε о эксп.	ε о расч. по (72)
Диэтиловый эфир	0	0.01	0.01
	0.040	0.22	0.22
	0.081	0.25	0.25
	0.166	0.28	0.27
	0.443	0.31	0.31
	0.649	0.35	0.34
	1	0.30-0.43*	0.40
Этилацетат	0	0.01	0.01
	0.015	0.18	0.16
	0.038	0.23	0.23
	0.077	0.27	0.28
	0.158	0.32	0.31
	0.428	0.36	0.36
	0.636	0.44	0.40
	1	0.48-0.50*	0.49
ТГФ	0	0.01	0.01
	0.134	0.33	0.30
	0.383	0.40	0.39
	0.591	0.48	0.43
	1	0.44-0.51*	0.48
Диоксан	0	0.01	0.01
	0.068	0.30	0.29
	0.140	0.34	0.33
	0.395	0.38	0.39
	0.603	0.48	0.43
	1	0.45-0.52*	0.50
ИПС	0	0.01	0.01
	0.003	0.27	0.25
	0.006	0.29	0.30
	0.012	0.31	0.33
	0.030	0.33	0.36
	0.061	0.36	0.37
	0.128	0.41	0.39
	0.369	0.46	0.42
	1	0.55	0.55

*Примечание: максимальный разброс значений по литературным данным[27].

Для бинарных смесей растворителей примерно равной элюирующей способности максимальная селективность достигается: а) если один компонент является очень сильным и присутствует в очень небольших количествах (например, 0.01% ДМСО в гексане); б) если оба компонента сравнительно слабые и более сильный компонент присутствует в большом количестве (например, смесь гексана и бензола, 20:80). Как правило, смеси со средней концентрацией каждого компонента характеризуются малой селективностью (смесь гексана и диэтилового эфира, 60:40).

Наибольший интерес представляют системы, в которых в качестве разбавителя используют гексан. В табл. 51 приведены экспериментальные данные по эффективной элюирующей силе смесей гексан – модификатор на силикагеле. Из 30 типов кривых в большей или меньшей степени адекватно аппроксимирующих изотермы ^о=f(φ₂) для ПФ типа гексан – модификатор, наиболее высокий коэффициент корреляции имели рациональные функции 4 порядка:

^о₁₂ =(k₁+k₂φ₂)/(1+k₃φ₂+k₄φ₂²) (70)

где k_i– эмпирические коэффициенты.

Преобразуем функцию (70) таким образом, чтобы заменить 2 коэффициента с неявным физическим смыслом значениями ^о разбавителя и модификатора, получим:

^о₁₂ ={^о₁+[^о₂(1+A+B)-^о₁]φ₂}/(1+Aφ₂+Bφ₂²). (71)

Уравнение (71) составлено так, чтобы соблюдались граничные условия: при ₂=0, ^о₁₂=^о₁; при ₂=1, ^о₁₂ =^о₂. Оптимизированные коэффициенты А и B уравнения (71) компенсируют друг друга. В=-0.3205А (R=0.9997). Компенсационный эффект обусловлен накладываемыми граничными условиями. Таким образом, получаем рациональное уравнение, в котором имеется только один эмпирический коэффициент, зависящий от типа модификатора

^о₁₂ ={^о₁+[^о₂(1+0.6795А)-^о₁]φ₂}/(1+Aφ₂-0.3205Aφ₂²). (72)

Сопоставление параметров теоретического уравнения (67) для разных растворителей, а так же полярности этих растворителей, выраженной в обобщенных критериях (Р^о или P_N) со значениями коэффициента А (табл. 52) позволяет выявить его физический смысл.

Таблица 52. Элюирующая сила ^о₂ модификаторов и эмпирические коэффициенты уравнения (72) для ПФ гексан – модификатор, ^о₁=0.01.

Модификатор	о2	А
Диэтиловый эфир	0.41	87.44
Этилацетат	0.50	64.93
ТГФ	0.51	16.68
Диоксан	0.52	44.68
ИПС	0.55	636.3

При переходе от диэтилового эфира, диоксана, ТГФ и этилацетата к ИПС коэффициент А увеличивается на порядок, при этом величина поперечного сечения молекулы с n₂=4.5-6 возрастает до n₂=8, и в 3 раза увеличиваются параметры полярности растворителя. Можно предположить, что к факторам, определяющим величину коэффициента А, относится площадь молекулы модификатора n₂ и совокупность полярных свойств, отражающих его способность к разным межмолекулярным взаимодействиям с разбавителем, сорбатом и адсорбентом.

Наряду с нелинейным уравнением (72) нами предложен способ описания изотерм элюирующей способности в хроматографической системе силикагель – гексан – модификатор при помощи линейных логарифмических анаморфоз и обоснован физический смысл констант в полученных зависимостях [1]. Для того чтобы лучше понять физический смысл факторов, влияющих на элюирующую способность бинарных смесей, целесообразно нахождение линейных приближений. Если допустить, что в чистом разбавителе ₂ стремится, но не равна нулю, т.е. всегда имеется остаточное количество полярного компонента в ПФ или на поверхности НФ, тогда зависимость ^о₁₂ от f(₂) для интервала концентраций модификатора ₂=0-1 можно выразить в логарифмических координатах в виде линейных уравнений (73). Такое допущение вполне обосновано, так как гексан даже после специального высушивания содержит следы влаги, а в реальной колонке, побывавшей в контакте с бинарными ПФ, несмотря на длительную стабилизацию, на поверхности силикагеля остаются следы воды и полярного модификатора. Т.е. наблюдаемую элюирующую силу гексана можно приписать не ему, а следам полярных растворителей, той же воде, присутствующей в хроматографической системе. Поэтому практически любое элюирование чистым разбавителем можно рассматривать, как происходящее с участием следов полярного модификатора.

log^о₁₂= log^о₂+ Вlog₂ (73)

Рассчитаем линейные корреляции (73) по набору данных ^о₁₂ приведенных в табл. 51 для силикагеля и серии типичных нормально-фазовых ПФ гексан – модификатор (ИПС, ТГФ, диоксан, диэтиловый эфир, этилацетат) без точки ₂=0. Получим достаточно высокую степень аппроксимации для всех серий бинарных ПФ (коэффициенты корреляции R=0.96-0.98). Вычислим по установленным корреляциям, какой концентрации модификатора может соответствовать величина ^о₁₂=0.01, приписываемая «чистому» гексану. Оказалось, что эта точка по корреляциям (73) экстраполируется к ₂≈1·10^-10 для ИПС и ₂≈1·10^-7 для других растворителей. Если принять эту экстраполированную точку для уточнения коэффициента В в корреляциях (73), степень их аппроксимации заметно возрастет (табл. 53). Коэффициент В обратно пропорционален площади, необходимой для размещения молекулы модификатора на поверхности, и активности НФ. При одинаковой активности НФ мы имеем коэффициент В для ИПС примерно на одну треть меньше, чем у других рассматриваемых модификаторов, а величину n₂, напротив, на 25-45% больше. Из уравнений (69) и (73) следует

В=(logN₂)/[(log₂)n₂]. (74)

Как показывают математические расчеты в бинарных смесях с гексаном коэффициент В приблизительно 1/n₂. Для расчета элюирующей способности активность силикагеля принимают равной =0.7 [1]. При такой активности силикагеля величина 1/n₂ действительно близка к найденным значениям В (табл. 53). Коэффициент В уравнения (73) изменяется обратно пропорционально значениям коэффициента А в зависимости (72). Это означает, что в обеих феноменологических моделях, несмотря на различия в математическом описании, прослеживается общность факторов, влияющих на зависимость элюирующей силы бинарных смесей от состава.

Уравнение (73) дает результаты расчетов с приемлемой для практических целей точностью во всем диапазоне концентраций модификаторов. К наибольшим отклонениям от эксперимента приводят расчеты по уравнению (73) в системе гексан – ИПС в области низких концентраций. Расчеты показывают более плавное изменение и менее высокие значения элюирующей силы на начальном отрезке изотермы, чем наблюдается в реальной системе, однако эти отклонения малы и эффект быстрого насыщения четко сохраняется. Феноменологическая модель (73) также может быть использована для расчета изоэлюотропных составов в рассмотренных ПФ. По сути, получен упрощенный вариант уравнения, теоретически выведенного Снайдером, в котором экспериментальные отклонения суммарной элюирующей силы от рассчитанной по (67) учтены в коэффициенте В.

Таблица 53. Полуэмпирические коэффициенты В уравнения (73) для ПФ гексан – модификатор.

Модификатор	n2	1/n2	о2	В
Диэтиловый эфир	4.5	0.317	0.41	0.229±0.006
Этилацетат	5.7	0.251	0.50	0.243±0.004
ТГФ	5.0	0.286	0.51	0.244±0.004
Диоксан	6.0	0.238	0.52	0.244±0.006
ИПС	8.0	0.179	0.55	0.168±0.008

Величины ^о₁₂, принятые за стандартные, могут применяться вместо ₂ в качестве независимой переменной в прогнозе фактора удерживания при сравнении хроматографических свойств сорбатов разного строения в элюентах, отличающихся не только составом, но и природой модификатора. Величина ^о₁₂ более удобна, чем ₂ отличающихся друг от друга модификаторов, так как позволяет наблюдать динамику изменения удерживания в единой системе координат. В тоже время ясно, что она не пригодна для точного прогноза элюирующей силы, ввиду того, что ^о зависит не только от типа модификатора, от его концентрации, от эффектов локализации, от типа и состояния сорбента, но и от строения соединений, по которым он определялся. Поэтому фактическое хроматографическое поведение полифункциональных соединений отличается от ожидаемого на основании величин ^о₁₂, принятых в качестве независимых переменных [27].

Феноменологические модели (72) и (73) удобны для расчета изоэлюотропных ПФ. Анализ приведенных полулогарифмических анаморфоз в работе [27] демонстрируют, что соединения более гидрофобные, с меньшим числом полярных групп или с менее полярными (более экранированными за счет стерических факторов или внутримолекулярных взаимодействий) группами, при прочих равных условиях имеют меньшие значения фактора удерживания.

В то же время, проекция экспериментальных параметров удерживания на взятые за основу изотермы ₂=^о₁₂ показала, что реальная элюирующая способность ПФ для конкретных хроматографических систем сорбат – элюент – сорбент в целом для диапазона ₂=0-1 остается нелинейной, поэтому при прогнозировании фактора удерживания в НФХ недостаточно экспериментально определить его при двух произвольных составах. Желательно, чтобы Δ₂ не превышала нескольких объемных процентов. Широкая экстраполяция может привести к существенной ошибке в определении величины фактора удерживания, предсказываемого расчетом.

На практике, получив по уравнению (72) или (73) соотношение растворителей в изоэлюотропной смеси и обнаружив, что в эксперименте она оказалась слишком низкой или слишком высокой, ее можно скорректировать, изменив содержание гексана.

В условиях распределительной НФХ кроме параметра e^о₁₂ элюирующую силу оценивают по параметру полярности P’,величина которого изменяется от –2.0 (фторзамещенные углеводороды) до 10.2 (вода). Изменение Р’ на 2 единицы приводит к десятикратному изменению фактора удерживания k. Величина Р’ для смеси растворителей определяется как среднее арифметическое

Р^’_сум = _iР^’_i, (75)

Величина Р’ для индивидуальных растворителей достаточно хорошо коррелирует с e^о (e^о≈0.1Р’). Р^’_сум является приближенной мерой оценки элюирующей способности растворителя в НФХ. Более точными критериями, чем Р^’ являются обобщенные критерии Р^о и Р_N, рассмотренные ранее, которые лучше коррелируют с e^о и дают удовлетворительный прогноз элюирующей силы ПФ, рассчитанной по аддитивному уравнению типа (75) при концентрациях модификатора >5%. В табл. 54 приведены изоэлюотропные ряды, рассчитанные по аддитивному уравнению (75).

Анализ экспериментальных данных в работе [27] показал, что изоэлюотропные ряды, построенные на основе обобщенных критериев полярности, дают в условиях распределительной НФХ систематические расхождения, если сопоставляются ПФ с модификаторами из разных групп селективности. Так, элюенты с ИПС и этанолом (II группа селективности), или с этилацетатом и диоксаном (VI группа) попарно образуют безупречные изоэлюотропные ряды, в то же время систематично отличающиеся между собой.

Неизбежные экспериментальные расхождения параметров удерживания в элюентах с одинаковой элюирующей силой, но содержащих модификаторы из разных групп селективности даже полезны, так как позволяют более тонко регулировать селективность хроматографической системы. Эти отличия не более допустимых для изоэлюотропных рядов по Схунмакерсу [12].

Таблица 54. Серия изоэлюотропных по величине Р^о ПФ для НФХ

Ро	0.022	0.027	0.0295	0.0396	0.047	0.117
Подвижные фазы	φ2
Изооктан – ИПС Гексан – ИПС Гексан – диоксан Гексан – диоксан – ИПС * Гексан – этилацетат Гексан – этилацетат – ИПС* Гексан – хлороформ Гексан – этанол Гептан – диоксан	0.029 0.015 0.027 0.026 0.025 0.024 0.025 0.012 0	0.042 0.03 0.052 0.051 0.050 0.049 0.050 0.024 0.025	0.05 0.035 0.071 0.07 0.07 0.069 0.070 0.03 0.04	0.078 0.065 0.12 0.119 0.115 0.114 0.115 0.055 0.095	0.1 0.086 0.155 0.154 0.150 0.149 0.150 0.072 0.135	0.3 0.29 0.52 0.519 0.50 0.499 0.50 0.24 0.51

*Примечание. Доля ИПС φ₃=0.001

При использовании концепции изоэлюотропных составов практически важным представляется то, что при изменении качественного состава изоэлюотропных смесей, можно примерно сохранить уровень удерживания и в тоже время улучшить селективность разделения. В рамках этого подхода полезным приемом является составление трехкомпонентных элюентов типа гексан ‒ диоксан – ИПС или гексан – этилацетат – ИПС, изоэлюотропных бинарным элюентам гексан – ИПС и гексан ‒ этилацетат (диоксан). Хроматографические системы с трехкомпонентными ПФ показали себя эффективней, чем с бинарными фазами, содержащими модификаторы VI группы. В то же время их селективность лучше селективности систем с бинарными спиртосодержащими ПФ. Небольшая добавка к разбавителю спирта уменьшает размывание пика фенолов, доводка элюента до необходимой элюирующей силы третьим компонентом - этилацетатом более мягко, чем одним спиртом, сближает объемы удерживания аналитов, существенно различающихся по способности удерживаться на сорбенте. Таким образом, при повышенных концентрациях полярных модификаторов в условиях распределительной ЖХ, когда адсорбционный механизм удерживания подавлен распределительным, точность оценки элюирующей силы по аддитивным уравнениям (75) возрастает.