4.2. Нормально-фазовая хроматография гидрофобных сорбатов

НФХ ионогенных гидрофобных соединений. Природные и синтетические фосфолипиды (ФЛ) применяются в качестве пищевой добавки (ПАВ), повышающей стабильность дисперсной системы, в виде которой находится продукт питания. ФЛ обладают положительным терапевтическим и профилактическим эффектом при самых разных заболеваниях, поэтому они находят применение в медицине и фармакологии [47]. Углеводородные радикалы ФЛ имеют 16-18 атомов С, а значит, их по нашей классификации следует отнести к гидрофобным соединениям, критерий гидрофобности Шатца Н=32-36. В то же время они содержат полярные ионогенные фрагменты, строение ионных форм которых сильно зависит от рН среды. Общая формула ФЛ имеет следующий вид:

где R₁ и R₂ – углеводородные радикалы, Х ‒ -Н, -СН₂-СН₂-N⁺(CH₃)₃, -СН₂-СН₂-N⁺H₃ и др.

В связи с особенностями строения, ФЛ хорошо или умеренно растворяются в растворителях, не очень совместимых для ВЭЖХ с УФ-детектированием (хлороформе, смеси хлороформа со спиртами, пиридине, ДМСО, ТГФ), сами при этом имеют заметные максимумы поглощения в той же области УФ спектра, что и хлороформ, ТГФ – 200-240 нм. Наличие сильнополярных групп позволяет проводить разделение ФЛ и в режиме НФХ. Наблюдали тенденцию, что наиболее гидрофобные триглицериды вымывались из колонки первыми, а наименее гидрофобные фосфатидовые кислоты вымывались последними, что соответствует в целом нормально-фазовому распределительному механизму удерживания. Однако в силу близких гидрофобных свойств и различий в строении полярной головки ФЛ, хроматографическое поведение ФЛ в условиях НФХ сложно прогнозировать, исходя из критерия гидрофобности Н. В тоже время, современное программное обеспечение пока не позволяет рассчитать для ФЛ величины logP. Смесь гептан – ИПС (1:1) достаточно хорошо растворяет ФЛ, имеет низкое УФ-поглощение, хорошие технико-эксплуатационных характеристики и достаточную элюирующую силу, аминофаза, в свою очередь, достаточно хорошо взаимодействует с гидроксильными группами и ионными формами полярных фрагментов ФЛ. Для ВЭЖХ этих липидов, как впрочем и других липидов, подходящими детектирующими устройствами являются лазерный детектор испарительного светорассеяния (ДИС), детектор заряженного аэрозоля (ДЗА), рефрактометрический детектор (РМД), а также МС-детектор.

Лазерный ДИС ‒ современный универсальный детектор, реагирующий на любые аналиты, которые менее летучи, чем подвижная фаза. Он имеет низкий фоновый сигнал, совместим с широким спектром растворителей, а также позволяет использовать градиентное элюирование (в отличие от РМД), и сигнал не зависит от степени насыщения и длины ацильных цепей (в отличие от УФ- или CФД-детектора). Лазерные ДИС в последние годы стали коммерчески доступны, они превосходят многие другие типы детекторов по чувствительности, стабильности и воспроизводимости аналитического сигнала в течение длительного периода анализа. Детектор ДЗА разработанный в конце 2004 г., по-видимому, является еще более чувствительным, чем лазерный ДИС и имеет широкие перспективы внедрения в аналитических лабораториях масложировой и молочной индустрии.

Одна из больших проблем аналитического определения ФЛ связана с их химической неустойчивостью. Они легко окисляются, особенно полиненасыщенные кислоты, входящие в гидрофобный фрагмент лецитинов. Так, линолевая кислота окисляется в 20 раз быстрее, чем олеиновая кислота, а каждая дополнительная двойная связь в жирных кислотах увеличивает скорость окисления в 2-3 раза.

НФХ гидрофобных соединений на примере каротиноидов. По предложению М. С. Цвета к каротиноидам (КР) относят полиеновые углеводороды ряда тетратерпенов (С₄₀-соединения) со структурой из изопреновых единиц. Ниже приведены структурные формулы двух КР.

Благодаря большому числу сопряженных двойных связей эти соединения поглощают свет в видимой области спектра и имеют окраску от желтого до красного цвета с интенсивной величиной молярного поглощения. Натуральный -каротин (С₄₀Н₅₆) активно используется в качестве пищевой добавки, обладающей полезной биологической активностью и улучшающей внешний вид продуктов питания, придавая им приятную желтую или оранжевую окраску. Другие природные кислородсодержащие КР – ксантофиллы, также являются экологически безопасными пищевыми красителями.

Ксантофиллы содержат в своем составе 1-2 гидрокси-, метокси-, карбокси-, кето- и эпоксигруппы. Одну гидроксильную группу имеет криптоксантин (С₄₀Н₅₆О), две гидроксильные группы ‒ у зеаксантина и лютеина (С₄₀Н₅₆О₂), альдегидную группу имеет -цитраин (С₃₀Н₄₀О₂) и т.д.

Гидрофобность КР варьирует в пределах Н=32-40 и logP=6.6-11.1. По нашей классификации каротины следует отнести к высокогидрофобным неполярным, а ксантофиллы ‒ к высокогидрофобным малополярным аналитам. В связи с тем, что они плохо растворяются в воде и полярных органических растворителях, наиболее удобным является метод НФХ, так как и экстрагент, и ПФ могут состоять из одинаковых растворителей, что упрощает пробоподготовку.

КР имеют электронные спектры поглощения с максимумами при 422-428, 444-450 и 472-484 нм, поэтому контроль над суммарным содержанием КР принято осуществлять с помощью СФД. ВЭЖХ совмещает в себе преимущества хроматографического разделения и спектрофотометрического определения содержания различных фракций КР. Анализ КР методом ВЭЖХ обобщен в работе [27], где описаны методики с применением колонок Сепарон СN и Сепарон SGX (3.3×150 мм), в качестве ПФ использовали смесь ИПС – гептан (2:98) и ИПС – гексан (0.1:99.9 или 1:99), расход ПФ – 0.5 мл/мин, λ=436 нм. Если СФД позволяет регистрировать поглощение при 450 или 480 нм, предпочтительнее использовать эти максимумы поглощения в качестве аналитических. Было установлено, что в условиях НФХ, в первом приближении соблюдается правило, чем выше гидрофобность КР, тем меньше их время удерживания. Для проверки порядка удерживания фракций с различной гидрофобностью использовали в качестве метчиков синтетический β-каротин (Е160), криптоксантин (Е161а) и кантаксантин (Е161g). Неокисленные изомеры и имеющие одинаковую полярность ксантофиллы в условиях НФХ элюируются быстро и практически не разделяются, т.е. -каротин и -каротин, к примеру, регистрируются сдвоенным пиком с плохим разрешением или одним пиком. Кислородсодержащие ксантофиллы получают возможность сорбироваться на полярном сорбенте. Чем больше полярных групп, тем сильнее специфическое взаимодействие молекулы сорбата с активными центрами сорбента, тем дольше удерживание. Следует отметить, что колонка с Сепароном СN, в отличие от колонок с «голым» силикагелем, показывает более стабильное воспроизведение параметров удерживания, в 2 раза дольше служит.

НФХ полифункциональных гидрофобных соединений. В работе [27 приведены условия ВЭЖХ ряда желтых, пурпурных и голубых цветообразующих компонентов фотоматериалов (ЦКФ) и исходных продуктов для их получения. ЦКФ из одних важнейших продуктов органического синтеза перешли в разряд малоиспользуемых реактивов в связи с тем, что аналоговая фотография была повсеместно, кроме узких областей исследований и фотоискусства, вытеснена цифровой фотографией, тем не менее, представляют большой интерес как образцы полифункциональных гидрофобных соединений, изучение хроматографического поведения которых позволяет выявить общие закономерности ВЭЖХ такого рода веществ. ЦФК имеют, как правило, несколько разнообразных функциональных групп (от 2 до 9 групп в молекуле), обеспечивающих заданные свойства при проявлении фотоматериалов [27] и являются высокогидрофобными соединениями (H=23-42, logP = 8-13). Общим их свойством является наличие в составе молекул высокогидрофобных алкильных, арильных, алкиларильных фрагментов, благодаря которым они не диффундируют из одного светочувствительного слоя в другой при производстве, хранении и проявлении фотоматериалов. В связи с тем, что максимумы поглощения для них лежат в области 270-313 нм и они плохо растворимы в полярных растворителях, для них в целом предпочтителен режим НФХ, а в качестве модификаторов пригодны этилацетат, хлороформ и диоксан, ТГФ и ИПС. Для ВЭЖХ наиболее гидрофобных ЦФК с Н=33-42 в чаще использовали в качестве НФ Силасорб 600, а в качестве ПФ гексан – диоксан − ИПС (80:16:4) или гексан – диоксан – этанол (94:4:2), Р^о= 0.024-0.047. Для аналитов с Н=22-28 успешно применяли в качестве НФ Силасорб 600 или Сепарон, модифицированный группами -NH₂ и -CN, а в качестве ПФ служили смеси гексан – диоксан, гексан – этилацетат, гексан – хлороформ, концентрация модификаторов в которых была 10-25 об. %, Р^о= 0.0260.066 [27].

Установлено, что в оптимизированных условиях НФХ между Н высокогидрофобных соединений (Н>25) и φ₂, Н и суммарной полярностью ПФ тесных корреляций нет. В одних случаях оптимальным условием является стандартный элюент гексан – ИПС (99.9:0.1), в других − требуется добавлять в ПФ до 25% модификатора. Это обусловлено рядом причин. Во-первых, по основным компонентам имел место разброс значений lоgk=1-10, что обусловлено задачей хроматографически разделить компоненты с их примесями, Н которых либо очень близки, либо, наоборот, существенно различаются, в зависимости от метода синтеза. Во-вторых, данные полученные на НФ разных производителей, в отличающихся по селективности и расходу ПФ, в стандартных или микроколоночных системах дают достаточно пеструю картину по параметрам удерживания ЦФК и продуктов, из которых они получены. Наконец, наличие и расположение объемных заместителей в молекулах аналитов может приводить к тому, что в одних случаях экранируется часть функциональных групп, способных взаимодействовать с НФ, в других случаях они остаются доступными для сорбции. Тем самым могут существенно нивелироваться различия между хроматографическими свойствами, например, анилида ароилуксусной кислоты (полупродукта желтых ЦФК) с Н=28 и самого ЦФК с Н=42.2. Вероятно, на времена удерживания этих соединений оказывает влияние строение части структуры молекулы, доступной для взаимодействия с активными центрами сорбента. С этой точки зрения нагляден пример ВЭЖХ фуллеренов, имеющих Н=60-94. Их разделение происходит не по числу атомов С, обуславливающих величину Н, а по ориентации той или иной структуры к поверхности сорбента. Если эти структуры одинаковы, тогда фуллерены элюируются одновременно. Вместе с тем можно отметить приблизительную тенденцию: если соединения с Н<20, растворимые в малополярных органических растворителях, нередко хроматографируют в стандартных малополярных ПФ типа гексан ‒ ИПС с долей модификатора 0.01-5 об. %, то для НФХ соединений с Н=20-35 чаще используют ПФ содержащие 10-30 об. % малополярных модификаторов типа хлороформа, диоксана, этилацетата, к которым для увеличения элюирующей силы добавляют небольшие количества спиртов (ИПС, этанол); а при разделении высокогидрофобных веществ (Н=35-45 и выше) φ₂ уменьшают до стандартных объемов, иногда отказываясь от них полностью. Как правило, количественный и качественный состав ПФ в ВЭЖХ высокогидрофобных соединений лимитируется растворимостью. Соединения, имеющие Н=25-40, максимально растворимы в малополярных апротонных растворителях (Р^о=0.2-0.3). Растворимость соединений с Н>35 в неполярных растворителях возрастает, что и позволяет снизить долю модификаторов.

Желтые ЦФК. Это производные анилидов ароилуксусных кислот, обладающие характерными свойствами: большая молекулярная масса (М=785-1022), высокая гидрофобность (Н=32.2–42.2), полифункциональность (6-9 функциональных групп в молекуле), термическая нестабильность, плохая растворимость во многих растворителях. Аналогичными свойствами обладают примеси, которые являются либо ароматическими β-кетоанилидами с близким строением, либо это сложные эфиры, имеющие строение отдельных фрагментов компонентов желтых ЦФК. Ниже приведен один из примеров желтых ЦФК:

Установлено, что в 10 важнейших растворителях для ВЭЖХ их растворимость изменялась в пределах 0—1000 г/л и сильно зависела не только от природы растворителя, строения соединения, температуры, но и от степени чистоты компонента и характера примесей. Максимальную растворимость желтые ЦФК проявляют в растворителях средней полярности (ТГФ, хлороформ, диоксан, этилацетат). Из-за гидрофобности, в 3-5 раз превышающей обычные величины аналитов, и практической нерастворимости в гексане и воде, являющихся основными составляющими ПФ в НФХ, и соответственно, ОФХ, были испытаны составы ПФ, содержащие максимально высокую долю модификаторов. В нормально-фазовом варианте ВЭЖХ доля модификаторов достигала 30, а в обращенно-фазовом — более 90 об.%. При выборе добавок учитывали не только растворимость в них компонентов, предел прозрачности в УФ-свете, элюирующую силу, но и другие технико-эксплуатационные показатели. Например, ТГФ во многих отношениях (низкая вязкость, умеренная элюирующая сила, хорошая растворимость анализируемых проб) предпочтительнее других растворителей в качестве добавки как в НФХ, так и в ОФХ. Однако ТГФ склонен образовывать пероксидные соединения, которые из соображений химической инертности ПФ и безопасности лабораторных работ необходимо удалять, а ТГФ применять свежеперегнанным.

Оптимизированные по составу ПФ для ВЭЖХ желтых ЦФК представляют собой трех-, четырехкомпонентные смеси, где в условиях НФХ к гексану в качестве модификаторов добавляют этилацетат или диоксан, совместно с ИПС или этанолом. В качестве четвертого компонента с целью улучшения формы пиков в отдельных случаях добавляли небольшие количества уксусной кислоты или триэтиламина. Добавка триэтиламнна особенно важна при анализе смесей, содержащих β-кетоэфир, который вследствие низкой скорости таутомеризации хроматографируется в НФХ в слабополярных ПФ двумя пиками енола и кетона, что нежелательно для количественного анализа. Введение триэтиламина нивелирует таутомерный эффект. Следует обратить внимание на вероятность хроматографического разделения таутомерных форм и самих желтых ЦФК, являются 3-дикарбонильными соединениями. В некоторых случаях при хроматографировании чистых образцов желтых ЦФК наблюдали раздвоение пиков. Однако специальное исследование для доказательства наличия таутомеров не проводили.

Для разделения желтых ЦФК с примесями наиболее благоприятен режим НФХ в тройных ПФ, имеющих узкий интервал полярности Р^о =0.03-0.06. В качестве НФ в режиме НФХ предпочтительнее использовать модифицированные пропилнитрильной группой силикагели типа Сепарон CN или Силасорб CN. Они обеспечивают стабильную воспроизводимость параметров удерживания и служат в 3-4 раза дольше, чем немодифицированные силикагели. В тоже время на сорбентах Силасорб 600 и Сепарон SGX в аналогичных ПФ, как правило, наблюдается более высокая селективность разделения близких по строению компонентов и их примесей.

Пурпурные ЦФК. Синтез пурпурных ЦФК осуществляют путем ацилирования аминопроизводных пиразолона-5 ангидридами или хлорангидридами соответствующих кислот, либо реакцией азосочетания полупродуктов с солями диазония. Ниже приведен пример пурпурной ЦФК.

Основными примесями в этих продуктах являются аминопиразолоны, ангидриды или кислоты, образующиеся из них в процессе выделения конечного продукта. Достаточно большие молекулярные массы, термическая нестабильность, наличие в молекуле хромофорных групп и ряд других особенностей указанных соединений определяют выбор метода ВЭЖХ с УФД в качестве способа аналитического контроля. Пурпурные ЦФК растворяются в малополярном хлороформе, диоксане и этилацетате. В неполярном гексане и в воде эти вещества нерастворимы, а в спиртах и в ацетонитриле малорастворимы. Значения критерия гидрофобности Н лежат в интервале 32-43, logP находятся в области 9-13. Таким образом, гидрофобность пурпурных ЦФК сопоставима с гидрофобностью желтых и для них следует ожидать аналогичного хроматографического поведения. Обращает на себя внимание общее свойство этих компонент: с увеличением гидрофобности их растворимость ухудшается не только в полярных растворителях, но и в средах с низкой полярностью. Это свойство существенно ограничивает возможности выбора состава ПФ. Наиболее благоприятные условия ВЭЖХ указанных компонентов также найдены в режиме НФХ с высоким содержанием модификаторов. Оптимизированные по составу ПФ представляют собой трехкомпонентные смеси, где к гексану добавлены диоксан или хлороформ совместно с этанолом. Общая объемная доля модификаторов составляет 15—30 об. %. Суммарная полярность ПФ такого состава характеризуется значениями Р⁰= 0.06-0.10.

В качестве НФ испытаны модифицированные пропилнитрильными группами силикагели типа Силасорб, Сепарон и Нуклеосил, а также немодифицированные силикагели. Колонки с модифицированными сорбентами служат в 2-3 раза дольше. Это обусловлено, по-видимому, тем, что функциональные группы пурпурных ЦФК и их примесей, имеющие основные свойства, вступают в довольно сильное взаимодействие с силанольными группами на поверхности силикагелей.

Голубые ЦФК. Эти компоненты имеют 2-4 полярных фрагмента и примерно в 1.5-2 раза менее гидрофобны, чем пурпурные и желтые ЦФК, для них характерны диапазоны гидрофобности Н=23-33, logP=8.3-10.3. Ниже приведена структура одной из голубых ЦФК.

Они, как правило, обладают хорошей растворимостью в растворителях средней полярности – хлороформе, диоксане. Несколько хуже они растворимы в этилацетате, ИПС и ацетонитриле. В этаноле и метаноле они растворяются при нагревании, плохо растворимы в гексане и нерастворимы в воде. Исходными продуктами для получения голубых ЦФК являются 2-нафтосалол, гидрофобный амин H₂NR или базовый компонент, из которого получают его модификацию, отличающуюся от базового компонента заместителем R. Таким образом, эти компоненты и их примеси имеют, как правило, лишь незначительные различия в функциональном составе молекул. Для них характерны близкие физико-химические свойства и высокая гидрофобность.

Для голубых ЦФК с заместителями R=C₁₄-C₂₀, хроматографическое разделение на две фракции C₁₄-С₁₆ и C₁₈-С₂₀ наблюдали только в условиях ОФХ - изо-кратической или градиентной. Наиболее благоприятные условия ВЭЖХ голубых компонентов, при которых не происходит разделения пиков гомологов, но достигается их разделение с примесями, найдены в режиме НФХ. Оптимизированные по составу ПФ представляли собой двух- или трехкомпонентные смеси, в которых к гексану добавляли диоксан, этилацетат или их смесь. Общая доля модификаторов составляла 10-25 об. %. Суммарная полярность ПФ такого состава характеризуется диапазонами значений Р^о = 0.033-0.074. В качестве НФ в режиме НФХ хорошо зарекомендовали себя амино- и нитрильные фазы. Для некоторых голубых ЦФК оптимальные условия анализа найдены только на аминофазах.