2.4. Оптические свойства

Прозрачность ПФ является критическим требованием при использовании УФД. Предел прозрачности для выбранного элюента должен быть короче аналитической длины волны λ. Предпочтение следует отдавать более прозрачным в УФ-свете элюентам, так как УФД в любом случае регистрирует суммарное поглощение ПФ и растворенного вещества, а его чувствительность определяется разностью между коэффициентами поглощения ПФ и сорбата. При повышенном фоновом поглощении (оптической плотности элюента при аналитической длине волны), предел обнаружения сорбата может быть заметно искажен шумом нулевой линии, сокращается рабочий диапазон линейности детектора. На рис. 29 приведены примеры трехмерных диаграмм зависимости оптической плотности A от состава бинарных ПФ в диапазоне 200-300 нм, полученные при 25 ^oC [5]. Видно, что изотермы A бинарных ПФ нелинейны, особенно в области ниже 250 нм. В интервале 270-300 нм в первом приближении величину A₁₂ можно считать аддитивной (отклонения от аддитивности составляют несколько процентов) и адекватно описывается линейной функцией:

A₁₂=A₂φ₂ +A₁(1-φ₂), (64)

где A₁₂ – оптическая плотность бинарной ПФ, A₁ и A₂ – оптическая плотность разбавителя и модификатора при i-той аналитической длине волны λ. Чем ближе λ к пределу прозрачности λ*одного из компонентов ПФ (A_i=1.0 при φ_i =1), тем более заметно проявляется неаддитивность A₁₂. В связи с этим, если сорбат имеет максимум поглощения в коротковолновой области УФ-света или удовлетворительную растворимость только в растворителях с длинноволновым пределом прозрачности λ*, или концентрация аналита близка к порогу чувствительности метода, учет неаддитивного характера изотерм оптической плотности позволяет улучшить чувствительность и надежность хроматографической методики анализа.

На рис. 30 даны зависимости λ*=f(φ₂) для ряда бинарных систем растворителей. Очевидно, что ни о каком соблюдении правила аддитивности для кривых λ*=f (φ₂) говорить не приходится. Такой вид кривых (кривые насыщения) нередко наблюдают при изучении сольватохромных эффектов бинарных растворителей на поглощение в УФ и видимой области спектров органических соединений с хромофорами [1]. Даже незначительное увеличение полярности смешанного растворителя может привести к резкому смещению спектра или увеличению интенсивности поглощения растворенного вещества. Так, зависимости А=f(φ₂) в коротковолновой области в бинарных системах гексан – диоксан, гексан – хлороформ, гексан – этилацетат, вода – ацетонитрил, вода – ТГФ, вода – диоксан имеют вид кривых насыщения. Для растворов в бинарных растворителях это явление трактуют особенностями микроструктуры ближайшего окружения молекул растворенного вещества. Считается, что молекулы сольвата селективно сольватируются более полярным компонентом бинарного растворителя за счет универсальных межмолекулярных сил ориентационной природы. В бинарных системах состав сольватной оболочки молекулы растворенного вещества может резко отличаться от состава раствора в целом, определяемого объемными соотношениями компонентов [1].

В эффект резкого возрастания величин λ* и А₁₂ при небольшом добавлении модификатора определенный вклад вносят, вероятно, не только УФ-поглощающие примеси, от которых не удалось полностью избавиться при очистке исходных растворителей, но также трансформация собственного поглощения модификатора, индуцированная изменением полярности среды, возможный вклад можнт внести релеевское рассеяние. Важным практическим выводом из найденного эффекта является необходимость учета возможного резкого ухудшения прозрачности элюента при повышении объемной доли в интервале φ₂=0-0.1 таких модификаторов, как диоксан, ТГФ, этилацетат, хлороформ, недостаточно очищенный ацетонитрил (это требование становится наиболее актуальным именно при использовании растворителей с невысокой степенью очистки).

Фиалковым показано [28, 29], что изотермы оптической плотности в двойных системах с химически невзаимодействующими компонентами максимально отклоняются от аддитивности в 5-6 раз больше, чем изотермы объемных свойств, и в 9-11 раз больше, чем изотермы показателя преломления. Абсолютные отклонения для каждой длины волны увеличиваются с увеличением содержания поглощающего компонента, а для каждой смеси – с приближением λ к максимуму поглощения. Таким образом, даже в смесях с высокочистыми растворителями будут наблюдаться отклонения от объемно-долевой аддитивности ΔА, вызванные не присутствием УФ-поглощающих примесей, а теми же физико-химическими равновесными процессами, возбуждающими отклонения от аддитивности объемных и рефракционных свойств.

Изотермы оптической плотности адекватно аппроксимируются параболическими функциями, аналогичными зависимости для плотности и показателя преломления бинарных систем:

A₁₂= A₁ +α A₁φ₂ + (A₂ –αA₁-A₁)φ₂² (65)

где A₁₂ – суммарная оптическая плотность при данной длине волны, α – эмпирический коэффициент. При ₂ = 0 или 1 значения A₁₂ равно A₁ или A₂. Уравнение (65) достаточно точно описывает изотермы не только в «слепой» для детектирования области длин волн, но и в наиболее важной в аналитической практике области 250-300 нм [5]. Экстремумы отклонений от аддитивности лежат вблизи составов φ₂=0.40-0.60, а их положение с точностью ±0.05 объемных долей совпадает с положением экстремумов в изотермах объемных свойств данных бинарных систем.

Для обращенно-фазовых ПФ с водой уравнение (65) можно упростить, приняв, что оптическая плотность воды А₁=0, тогда:

A₁₂=(A₂ – α)φ₂+ αφ₂² , (66)

где α - эмпирический коэффициент. Уравнение (66) точнее, чем линейная регрессия описывает экспериментальные данные (табл. 50).

Таким образом, анализ диаграмм A₁₂=f(φ₂) указывает на возможность существования не только "кажущихся" отклонений от закона Бугера – Ламберта - Бера, вызванных примесями, релеевским рассеиванием или аппаратурными артефактами (неидеальной монохроматичностью потока лучистой энергии, флуктуациями температуры, большой погрешностью измерения величин А>2), но и "истинных" отклонений, связанных с протеканием процессов ассоциации и диссоциации и степенью сольватации поглощающих частиц. К пределу прозрачности λ* чистого растворителя не надо подходить как к абсолютному пороговому значению, исключающему возможность использовать данный растворитель при аналитической длине волны ниже предела его прозрачности в УФ-свете. Элюенты, содержащие 5-10 % такого растворителя в качестве модификатора, имеют приемлемый уровень фонового поглощения, не мешающий анализу на более низких длинах волн.

а)	б)
в)	г)
д)	е)
Рис. 29. Зависимость оптической плотности от φ2 и длины волны для ПФ: а) гексан – этилацетат; б) вода – метанол; в) гексан – ИПС; г) вода – ацетонитрил; д) гексан – диоксан; е) гексан – хлороформ

Можно привести пример возможности применения кетонов в качестве малообъемного модификатора (объемная доля <10 об. %) для анализа в диапазоне λ =205-220 нм, несмотря на то, что их пределы пропускания находятся в области λ*=320-340 нм. Такая возможность обнаружена при изучении УФ-спектров водных растворов кетонов (рис. 31), имеющих «окно» – минимум поглощения в области 210 нм.

Рис. 30. Зависимость предела прозрачности λ* от состава ПФ: гексан - хлороформ (1), гексан - этилацетат (2); гексан - диоксан (3); вода - ацетонитрил (4); вода – ТГФ (5); гексан - этанол (6); изооктан – ИПС (7); гексан - ИПС (8), вода - метанол (9)

К оптическим свойствам бинарных растворителей следует отнести не только собственное поглощение, но и специфические эффекты растворителей на спектры поглощения (сольватохромные эффекты). Причина этих эффектов заключается во взаимодействии между молекулами растворенного вещества и растворителя, которые изменяют разность энергий между основным и возбужденным состояниями поглощающих частиц, содержащих хромофорную группу. При увеличении доли полярного компонента может наблюдаться либо гипсохромный сдвиг (голубой или коротковолновый), либо батохромный (красный или длинноволновый) сдвиг.

Наиболее сильный сольватохромный эффект характерен для молекул с -электронной системой, в которых распределение зарядов (дипольный момент) в основном и возбужденном состоянии сильно различаются. Наиболее чувствительны к полярности смешанного растворителя бетаиновые красители [25]. Максимумы поглощения бетаиновых красителей при увеличении полярности смеси могут смещаться с 769 до 515 нм. Антоциановые красители в водно-спиртовых растворах при увеличении доли воды от =0 до 1 изменяют максимум поглощения с 520-538 нм до 500-508 нм, а азосоединения – с 630-550 до 550-475 нм, сопряженные карбонилсодержащие соединения при замене метанола на воду дадут гипсохромный сдвиг на 8 нм [5].

Рис. 31. Зависимость оптической плотности от φ₂ и длины волны для ПФ вода ‒ ацетон

Таблица 50. Коэффициенты α уравнения (2.26) для изотерм оптической плотности обращенно-фазовых ПФ при 25 ^оС

Система	λ, нм	А2	α
Вода – метанол	250	0.220	-0.06 ±0.01
	260	0.101	-0.08 ± 0.02
	270	0.080	-0.03 ±0.01
	280	0.052	-0.03 ±0.01
Вода – ТГФ	250	0.297	0.16±0.04
	260	0.070	0.011 ±0.003
	270	0.070	-0.010 ±0.004
	280	0.059	-0.021 ±0.004
Вода – ацетонитрил	250	0.521	-1.01 ±0.12
	260	0.225	-0.51 ±0.10
	270	0.090	-0.23 ± 0.04
	280	0.084	-0.19±0.04

Следует иметь ввиду, что на оптическую прозрачность бинарных систем растворителей с водой влияет не только чистота органического растворителя, но и воды. Для иллюстрации этого тезиса на рис. 32 приведен УФ-спектр дистиллированной воды, зарегистрированный без кюветы сравнения.

Рис. 32. УФ-спектр воды без кюветы сравнения

Таким образом, при оптимизации условий ВЭЖХ следует учитывать, что изменение состава ПФ приводит не только к изменению селективности и эффективности хроматографической системы, но и к нелинейному изменению порога прозрачности ПФ и изменению максимума поглощения определяемого вещества, иногда весьма существенного.