1

О . Б. Рудаков, В. Ф. Селеменев, Л. В. Рудакова

В ЭЖХ. Сорбаты, сорбенты и элюенты

Воронеж 2016

М инистерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

«Воронежский государственный архитектурно-строительный университет»

О. Б. Рудаков, В. Ф. Селеменев, Л. В. Рудакова

ВЭЖХ.

Сорбаты, сорбенты и элюенты

Монография

Воронеж, 2016

У ДК 543.544

ББК Г471

Р83

Рецензенты:

А. Н. Зяблов, д-р хим. наук, доцент, зам. декана химического факультета Воронежского государственного университета;

Н. И. Пономарева, д-р хим. наук, профессор, зав. кафедрой химии

Воронежского государственного медицинского университета

им. Н. Н. Бурденко

P83	Рудаков, О.Б ВЭЖХ. Сорбаты, сорбенты и элюенты : монография / О.Б. Рудаков, В.Ф. Селеменев, Л.В. Рудакова; Воронежский ГАСУ. – Воронеж, 2016. – 205 с.

Рассмотрены хроматографические свойства основных классов органических веществ, экотоксикантов, биологически активных веществ, фармпрепаратов, функциональных добавок в различные виды продукции. Представлена информация о свойствах типовых сорбентов для ВЭЖХ, а также рассмотрены физико-химические и технические свойства индивидуальных и бинарных растворителей, используемых в качестве компонентов подвижных фаз для ВЭЖХ. Рассмотрены приемы оптимизации состава элюентов с учетом свойств сорбатов и характеристик хроматографической аппаратуры, методология экспертной оценки качества хроматографических методик. Дана справочная информация о компонентах хроматографических систем сорбат – сорбент – элюент.

Книга предназначена специалистам, занимающимся вопросами определения биологически активных и токсических веществ в природном сырье, в пищевой, технической и фармацевтической продукции, в объектах окружающей среды. Кроме того, может быть полезна студентам бакалавриата, магистратуры, СПО и аспирантам при изучении важнейшего раздела аналитической химии – хроматографические методы анализа.

Ил. 85. Табл. 80. Библиогр.: 50 назв.

УДК 543.544

ББК Г471

Работа выполнена при поддержке Минобрнауки России

в рамках государственного задания вузам в сфере научной деятельности

на 2014-2016 годы. Проекты № 951 и 3837.

ISBN 978-5-89040-627-9 © Рудаков О.Б., Селеменев В.Ф.,

Рудакова Л.В., 2016

© Воронежский ГАСУ, 2016

Оглавление

	Введение………..…………………………………………………	4
Глава 1	ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ СОРБАТ – ЭЛЮЕНТ – СОРБЕНТ….............................................	8
1.1	Тенденции и проблемы ВЭЖХ….………………………………	8
1.2	Физико-химические критерии совместимости компонентов системы сорбат – элюент – сорбент……………………………..	14
1.3	Хроматографические свойства сорбатов……..………………..	17
1.3.1	Полярность и гидрофобность……………..……………………....	18
1.3.2	Строение сорбата и растворимость…………..…………………..	22
1.3.3	Оптические свойства….…………………………………….…..	28
1.3.4	Рефракционные свойства…………………………………………	33
1.4	Сорбенты для ВЭЖХ…………………………………………….	34
1.4.1	Сорбенты для нормально-фазовой хроматографии…………..	34
1.4.2	привитые сорбенты для нормально-фазовой хроматографии……………………………………………………	36
1.4.3	Сорбенты для обращенно-фазовой хроматографии……………	38
1.4.4	Сорбенты для эксклюзионной хроматографии…………………	43
1.4.5	Количественная оценка полярных свойств сорбентов………..	45
1.5	Хроматографические свойства индивидуальных растворителей……………………………………………………..	48
1.5.1	Оптические свойства…………………………………………….	52
1.5.2	Полярность и элюирующая сила………………………………..	56
1.5.3	Смешиваемость. Миксотропный ряд………….…….……….....	64
1.5.4	Обобщенные критерии полярности растворителей……………..	67
1.5.5	Обобщенные критерии элюирующей силы растворителей……	72
Глава 2	ИЗОТЕРМЫ СВОЙСТВ БИНАРНЫХ ПОДВИЖНЫХ ФАЗ…	76
2.1	Плотность и объемные свойства………………………………..	76
2.2.	Вязкость………………………………………………………......	84
2.3	Показатель преломления………………………………………..	92
2.4	Оптические свойства……………………………………………	101
2.5	Элюирующая сила…………………………………………….....	107
2.5.1	Элюирующая сила в нормально-фазовой хроматографии……	108
2.5.2	Элюирующая сила в обращенно-фазовой хроматографии…..	116
Глава 3	ИЗОБАРЫ ТЕМПЕРАТУРЫ КИПЕНИЯ БИНАРНЫХ ЭЛЮЕНТОВ………….....................................................................	121
3.1	Азеотропные составы бинарных растворителей, перспективы применения в ВЭЖХ	121
3.2	Инвариантное описание изобар температур кипения бинарных растворителей……………………………………………………	126
Глава 4.	ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ УДЕРЖИВАНИЯ СОРБАТОВ	139
4.1	Нормально-фазовые системы сорбат – элюент – сорбент…….	139
4.2	Нормально-фазовая хроматография гидрофобных сорбатов….	145
4.3	Разделение и идентификация таутомерных форм гидрофобных β-кетоэфиров в условиях нормально-фазовой хроматографии….	153
4.4	Обращенно-фазовые системы сорбат – элюент – сорбент…….	158
4.5	Обращенно-фазовая хроматография некоторых гликозидов…	168
Глава 5.	ХЕМОМЕТРИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ ОПТИМИЗАЦИИ МЕТОДИК ВЭЖХ.............................................................................................	171
5.1	Принципы построения поисково-аналитических систем для ВЭЖХ
5.2	Применение обобщенных критериев в оптимизации условий ВЭЖХ	178
5.3.	Оценка оптимальности состава бинарной подвижной фазы по обобщенным целевым функциям…………………..…………	186
	ГЛОССАРИЙ……………………………………………………..	195
	СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................	200
	Основные обозначения и используемые сокращения………...	202

Введение

Divide ut regnes

Жидкостная хроматография изучает межмолекулярные взаимодействия и перенос молекул или частиц в системе из двух несмешивающихся фаз − стационарной и подвижной. В зависимости от варианта хроматографии в качестве неподвижной фазы (сорбента) используют немодифицированные и модифицированные силикагели, синтетические или искусственные полимерные материалы. В качестве подвижной фазы (элюента) используют смешанные растворители, включающие хроматографически малоактивный разбавитель и один или несколько модификаторов (хроматографически активных растворителя), которые для выбранного варианта обладают бóльшей элюирующей способностью, чем разбавитель.

В монографии рассмотрены физико-химические системы сорбат – элюент (подвижная фаза) – сорбент (неподвижная фаза) в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в широкой области изменений структуры сорбата и состава подвижной фазы в зависимости от типа сорбента и механизма удерживания.

В настоящее время ВЭЖХ во всем ее многообразии получила самое широкое применение в аналитической, органической химии, биотехнологии, биохимии, медицине, микробиологии, фармацевтике, экологии как метод разделения, выделения и анализа органических соединений самого разнообразного строения. Благодаря неограниченной возможности варьировать состав элюента и тип сорбента, а также благодаря техническому прогрессу в аппаратурном оснащении и компьютеризации эффективность методов ВЭЖХ в решении аналитических задач чрезвычайно возросла. Практически не существует объектов, для хроматографического разделения которых не удалось бы найти подходящего сорбента, систем растворителей и способов детектирования.

В связи с высоким уровнем развития методов ВЭЖХ, происходит замена в системе аттестованных методик и ГОСТ классических химических (гравиметрических, титриметрических) и инструментальных (электрохимических, спектрофотометрических и др.) методик анализа на методики, основанные на хроматографических методах. Эти методики сочетают в себе преимущества хроматографического разделения с оптическими, электрохимическими и иными способами детектирования разделенных компонентов (сорбатов). Однако, несмотря на множество преимуществ, методы ВЭЖХ отличаются высокой себестоимостью единичного анализа, сложной хроматографической аппаратурой, дорогостоящими колонками, которые предъявляют ряд жестких требований к вводимой пробе и подвижной фазе. Поэтому в книге подробно рассмотрены вопросы совместимости аналитов, подвижных и неподвижных фаз и методов детектирования.

Чтобы сократить «холостое» время эксплуатации хроматографов, уменьшить расходы и трудозатраты на разработку методик, в последнее десятилетие активно разрабатываются информационно-поисковые и экспертные системы, позволяющие по установленным закономерностям, с минимальным предварительным экспериментом находить подходящие условия разделения и детектирования анализируемых компонентов. Стандартизированные методики в свою очередь не могут идентично воспроизводиться на разных хроматографических системах, имеющих номинально близкие характеристики. Для адаптации методики к конкретному хроматографу и колонке требуется так же какое-то количество подгоночных экспериментов, уточняющих в первую очередь состав и расход элюента. Для минимизации этой процедуры целесообразно применение ряда известных правил и закономерностей. Разработка информационно-поисковых и экспертных систем для различных методов химического анализа является одним из приоритетных и актуальных проблем современной аналитической химии, поэтому в книге обсуждено современное состояние этих вопросов.

В связи со сложностью гетерогенных хроматографических процессов на границе жидкость – твердый сорбент в теории ВЭЖХ еще много пробелов. Известные модели удерживания дают удовлетворительный прогноз только в узких областях состава элюентов, отсутствует универсальный математический аппарат, позволяющий описывать хроматографические свойства многокомпонентных подвижных фаз (ПФ) в широком интервале концентраций модификатора. Мало изучены свойства хроматографических систем в условиях с низкой селективностью разделения, вместе с тем, измерения параметров удерживания сорбатов в этих, казалось бы, не имеющих практический интерес областях позволяет построить более точные модели удерживания в типовых условиях хроматографирования.

Проблемным с практической и теоретической точки зрения остаются качественные и количественные характеристики полярности индивидуальных и смешанных растворителей. Полярность растворителя определяет его способность растворять вещество, смешиваться с разбавителем, элюировать сорбат через слой сорбента. В настоящий момент отсутствует общепризнанный и универсальный подход в количественном определении элюирующей способности растворителей. Это мешает сопоставлять хроматографическое поведение сорбатов в элюентах, состоящих из растворителей разной природы. В книге обсуждены критерии полярности и элюирующей силы растворителей, предложены обобщенные критерии, которые могут быть полезными при прогнозировании и интерпретации хроматографических свойств элюентов.

Актуальной проблемой является оценка качества хроматографической методики, предназначенной для массовых определений. Оно зависит от большого числа факторов (времени анализа, стоимости материалов, техники безопасности лабораторных работ, совместимости элюентов с техническими характеристиками хроматографической аппаратуры и т.д.). В монографии рассмотрены процедуры оптимизации технико-эксплуатационных характеристик методик, предложены количественные критерии их качества.

Злободневной проблемой, вызвавшей, в частности, развитие аналитической ВЭЖХ, является фальсификация многокомпонентных натуральных и синтетических смесей аналитов в фармацевтической, парфюмерной и пищевой промышленности. Поэтому в работе обсуждены приемы идентификации многокомпонентных смесей вариативного состава по хроматографическим данным.

В монографии широко использованы концепции, справочные материалы и методологические подходы, ранее опубликованные Рудаковым О.Б. в соавторстве в таких книгах как «Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии», «Физико-химические системы сорбат – сорбент – элюент в жидкостной хроматографии», «Растворитель как средство управления процессом в жидкостной хроматографии», «Колоночная аналитическая хроматография как объект математического моделирования», «Информационные системы и цифровые технологии в аналитике и контроле биологически активных веществ» и др. [1-5]. Эти книги были изданы небольшими тиражами, быстро разошлись и стали раритетными сразу после выхода в свет, тем не менее, они активно распространяются «пиратами» в формате «дежавю» (DJVU). В настоящем печатном издании справочная информация по системам сорбат – сорбент – элюент дополнена или уточнена.

В книге использованы термины, рекомендованные нормативной литературой, ИЮПАК и РАН [6-10], так как в аналитической химии принято оперировать стандартизированными и метрологически согласованными понятиями. Основные термины и дифениции представлены в специальном глоссарии.

Книга может служить учебным пособием для студентов среднего специального образования, обучающимся в бакалавриате, магистратуре и аспирантуре по важнейшему разделу аналитической химии – хроматографическим методам анализа, а также работникам аналитических лабораторий, оснащенных оборудованием для высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Книга подготовлена ведущими учеными в области аналитической химии г. Воронежа, специализирующимися на определении биологически активных и токсических веществ в природном сырье, в пищевой, технической и фармацевтической продукции, в объектах окружающей среды. Доктор химических наук, профессор Рудаков О.Б. ‒ заведующий кафедрой химии ВГАСУ, автор более 500 публикаций, доктор химических наук Селеменев В.Ф. – заслуженный деятель науки России, заведующий кафедрой аналитической химии ВГУ, автор более 1000 публикаций, Рудакова Л.В. – заведующий кафедрой фармацевтической химии и фармацевтической тегнологии ВГМУ, автор 125 публикаций. Раздел книги 3.2 подготовлен кандидатом физико-математических наук Преображенским М.А., доцентом кафедры физики ВГАСУ.

Глава 1.

Хроматографические системы

сорбат – элюент – сорбент

1.1. Тенденции и проблемы вэжх

Физико-химические системы сорбат – элюент – сорбент составляют триаду субстанций, знание закономерностей взаимодейсвия внутри которой позволяет эффективно управлять хроматографическим процессом и успешно реализовывать разделение и определение веществ с помощью хроматографии.

Термин хроматографический метод впервые введен в научный обиход 110 лет назад первооткрывателем хроматографии М.С. Цветом [11]. М.С. Цвет не только открыл хроматографический способ разделения и нашел практическое применение для жидкостной хроматографии (ЖХ), но и дал первоначальную трактовку, за счет каких физико-химических явлений это разделение происходит, отметив роль адсорбции и сорбционных равновесий. Тогда же Цвет пришел к выводу, что, варьируя состав растворителя, можно целенаправленно управлять хроматографическим процессом. «Хлорофиллины не извлекаются из листьев чистым бензином не потому, что они были бы в нем нерастворимы, а потому, что они удерживаются в хлоропластах молекулярными силами. Точно таким же образом удерживается и хлорофилл, и гипохлорин. Каротин же легко выщелачивается, но достаточно прибавить к бензину одну сотую спирта, чтобы молекулярные силы были преодолены и все пигменты переходят в раствор, равно как и гипохлорин… Гипохлорин и пигменты, внедренные в фильтровальную бумагу, полотно или крахмал, относятся к бензину точь в точь, как они это делают в хлоропласте. Внедренные же в песок или в свободном виде они растворяются в бензине и, следовательно, действие спирта не химическое, а физическое, … молекулярные силы, удерживающие компоненты хлороглобина (за исключением каротина) в хлоропластах или бумаге должны быть отнесены к категории адсорбционных». В своих работах Цвет впервые четко показал сложный характер взаимодействий в системе сорбат – элюент – сорбент. Он подробно изучил не только свойства 126 адсорбентов, но и сорбционные свойства воды, спиртов, ацетона, хлороформа, петролейного эфира, бензола и других растворителей. Им же первым дана классификация хроматографических растворителей по их «электродиссационной силе» (полярности), в качестве критерия полярности растворителя Цвет предложил использовать диэлектрическую проницаемость.

Наиболее интенсивное развитие ЖХ в научном и прикладном плане получила в последние 35 лет, с того момента как стал разрабатываться высокоэффективный вариант ЖХ, получивший название высокоэффективная жидкостная хроматография. Применение сорбентов с размером частиц 3-10 мкм позволило резко увеличить эффективность хроматографического разделения. Однако для элюирования подвижной фазы (ПФ) через высокоэффективные колонки нужны насосы с большим рабочим давлением 1-20 МПа, способные точно поддерживать заданный расход элюента. Это существенным образом усложняет требования к конструкции жидкостного хроматографа. В зависимости от способа элюирования различают изократические и градиентные жидкостные хроматографы. Устройство изократического хроматографа представлено на рис. 1.3.

ПФ из емкости (1) через входной фильтр (9) подается прецизионным насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3) – ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Далее, через in-line фильтр (8), образец с потоком ПФ поступает в элемент разделения (4) – через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных – интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться: с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), с клавиатур каждого из модулей системы; или производиться управляющей программой с компьютера.

Рис. 1. Схема изократического хроматографа

Для градиентного элюирования используют 2 принципиально различных типа жидкостных хроматографов. Они отличаются точкой формирования градиента состава ПФ. Первый тип – системы с формированием состава ПФ на линии низкого давления (рис. 2).

ПФ из емкостей (1) через входные фильтры (9) и программатор градиента (10) подается насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3), туда же вводится проба. Работой клапанов программатора градиента управляет либо управляющий модуль, либо управляющая программа компьютера. Системы такого типа формируют бинарный, тернарный или кватернарный градиент. Форма функции градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Пройдя через in-line фильтр (8), образец с потоком ПФ поступает в колонку (4), а затем элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на регистратор (6). В настоящее время – это компьютер, оснащенный программой для сбора и обработки хроматографических данных.

Несмотря на кажущуюся привлекательность таких систем (в них используется всего лишь один прецизионный насос высокого давления), они обладают рядом недостатков, среди которых основным является жесткая необходимость тщательной дегазации компонентов ПФ еще до смесителя низкого давления (камеры программатора градиента). Она осуществляется с помощью специальных проточных дегазаторов. Из-за этого факта стоимость их становится сравнимой с другим типом градиентных систем – систем с формированием градиента состава ПФ на линии высокого давления. Принципиальным отличием этих систем является смешивание компонентов непосредственно в линии высокого давления. При данном подходе количество прецизионных насосов определяется количеством резервуаров для смешивания ПФ. При таком подходе требования к тщательности дегазации компонентов существенно снижаются.

Схема градиентной системы ВЭЖХ с формированием состава ПФ на линии высокого давления представлена на рис. 3.

ПФ из емкостей (1) через входные фильтры (9) подается прецизионными насосами высокого давления (2 и 11) через статический или динамический смеситель потока (10) в систему ввода образца (3), туда же вводится проба. Работой насосов управляет либо управляющий модуль системы (насос «master pump» или контроллер), либо управляющая программа компьютера. Системы такого типа формируют бинарный или тернарный градиент. Через in-line фильтр (8) образец с потоком ПФ поступает в разделительную колонку (4), затем элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на регистратор (6).

Предложенные схемы являются достаточно упрощенными. В состав систем могут быть включены дополнительные устройства – термостат колонок, системы постколоночной дериватизации, системы пробоподготовки и концентрирования образца, рециклер растворителя, мембранные системы подавления фоновой электропроводности (для ионной хроматографии), дополнительные защитные системы (фильтры, предколонки) и т.д.

Рис. 2 . Первый тип градиентного хроматографа

Таким образом, радикальное усложнение технического сопровождения хроматографического процесса приводит к возникновению ряда требований к свойствам элюентов и сорбентов, отсутствующих в классической колоночной и планарной (токослойной) ЖХ. Жидкая фаза должна быть пригодна для детектирования (быть прозрачной в заданной области спектра, или иметь низкий показатель преломления, определенную электропроводность, или диэлектрическую проницаемость и т.д.), инертна к материалам деталей хроматографического тракта, не образовывать газовых пузырей в клапанах насоса и ячейке детектора, не иметь механических примесей.

Важную роль приобретает пробоподготовка, в итоге которой должен получиться истинный раствор смеси аналитов, с достаточной концентрацией, необходимой для детектирования. Требуется, чтобы этот раствор был совместимым с другими элементами хроматографической системы, невыполнение этого требования может привести к критическим условиям работы прибора. Для сорбентов важнейшими требованиями являются химическая инертность по отношению к аналиту и ПФ, прочность и способность стабильно эксплуатироваться при высоких давлениях. Зернение и размер пор сорбента, его тип должны соответствовать техническим характеристикам хроматографа.

Рис. 3. Второй тип градиентного хроматографа

Систематизация критериев совместимости компонентов хроматографической системы сорбат – элюент – сорбент, привязанных к техническим характеристикам хроматографического тракта и его периферии, основанная на изучении фундаментальных физико-химических явлений, сопровождающих хроматографический процесс, является приоритетным предметом исследования современной аналитической ЖХ [4].

Активно разрабатываются информациионно-поисковые и экспертные системы, позволяющие априори предсказывать поведение сорбатов в заданных условиях ЖХ в зависимости от их структуры, состава элюента, параметров колонки, метода детектирования, изократического или градиентного режима подачи ПФ, величины рН, температуры, давления, а по характеру нарушений работы хроматографа прогнозировать причины неисправностей и выдавать рекомендации по их устранению [5].

Анализ публикаций, посвященных ВЭЖХ, и рынка хроматографических приборов, показывает, что каждая 10-я работа посвящена вопросам теории и общим вопросам, 2-3% работ посвящены установлению связи структуры молекулы сорбата с параметрами удерживания, 20-30% - сорбентам, 15-20% - детекторам, до 10% - аппаратуре и периферии хроматографической системы, от 5 до 15% - компьютеризации и автоматизации хроматографического процесса. Примерно половина лабораторий используют обращенно-фазовую ВЭЖХ, в четверти исследований используют нормально-фазовую ВЭЖХ, около 10% - эксклюзионную и ионообменную ЖХ, 40-45% ежегодных публикаций рассматривают в качестве объектов исследования лекарственные, биологически-активные вещества и фармацевтические препараты, 10-15% составляет доля публикаций по ЖХ продуктов промышленной химии, нефтехимии и тонкого органического синтеза, столько же исследований посвящено другим техническим продуктам, экотоксикантам, пищевым добавкам и компонентам продуктов питания. Так, из года в год стабильно публикуются примерно по 120-150 статей по ВЭЖХ витаминов, 100-150 публикаций – по липидам, 200-250 – по углеводам, 130-220 – по аминокислотам. В совокупности методы ЖХ покрывают область аналитов с диапазоном молекулярных масс от 10² до 10⁷.

Если вычленить отдельные направления исследования обозначенных выше проблем, наиболее значительные прорывы наметились в следующем:

а) разработка высокостабильных и селективных сорбентов;

б) автоматизации и компъютеризация аппаратуры;

в) миниатюризация методов и аппаратуры;

г) разработка новых и повышение чувствительности существующих детекторов, удешевление детектирующей аппаратуры;

д) развитие методов пробоподготовки и концентрирования аналитов с использованием методов твердофазной экстракции, жидкостно-жидкостной экстракции, экстракционного вымораживания;

е) внедрение ВЭЖХ в важнейших сферах человеческой деятельности – в биологии, биотехнологии, медицине, фармации, экологии, пищевой промышленности, бытовой химии, контроле качества и безопасности материалов и изделий

ж) разработка информационно-аналитических и экспертных систем в области ВЭЖХ.

3) разработка и усовершенствование ультраэффективных систем (УЭЖХ), систем двухмерной хроматографии ГХ-ВЭЖХ, ВЭЖХ-ВЭЖХ.