1.Приготування реактиву Фоліна

Для визначення білка за методом Лоурі слід використовувати розчини з нейтральними значеннями рН.

а) Реактив А. З’єднати у мірній хімічній склянці (1000 мл) з 20,0 г карбонату натрію (Nа2СОз) і 4,0 г гідроксиду натрію (Nа ОН). Довести до мітки 1000 мл дистильованої водою.

б)Реактив Б. З’єднати у мірній хімічній склянці 0,5 г сульфату міді (СuSO4 5Н2О) й 1,0 г цитрату натрію (Nаз-цитрат). Довести дистильованою водою до 100 мл.

в)Реактив С.Змішати 50 мл реактиву А й 1 мл реактиву Б;

г)Реактив Е (реактив Фолина). В хімічну склянку, емністю 1000 мл, внести 100 г Nа2WO4 2Н2О и 25 г Nа2МоО4 2Н2О. Додати 700 мл дистильованої води й повністю розчинити сіль. Внести 50 мл 85 %-ного розчину НзРО4. Перемішати. Додати 100 мл концентрованої НСl. Суміш кип'ятити із зворотним холодильником протягом 10 годин, потім внести 150 г LiSO4, 50 мл дистильованої води й декілька крапель брому або бромистої води. Розчин кип'ятити без холодильника протягом 15 хв. для видалення надлишку брому. Охолодити, довести об'єм суміші до 1000 мл. Зберігати в темному місці, застосовувати в двократному розведенні.

2.Підготувати спектрофотометр до роботи.

Підготовка спектрофотометра до роботи у видимій області спектра й спектрофотометрія підготовлених зразків здійснюється при 750 нм. При виконанні вимірів керуються інструкцією, що додається до приладу

3.Порядок проведення аналізу

1.Виготовлення зразків з відомою кількістю білка.

Внести в пробірку 10 мл розчину хлориду натрію (0,15 міль/л) і 10 міліграм высокоочищенного контрольного білка й розмістити у штативі дванадцять пробірок, як наведено в таблиці 6.8

Таблиця 6.8.

Визначення кількості білка за методом Лоурі

Інгредієнт	Об’єм інгредієнту
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Контрольний розчин білка, мл	0,1	0,2	0,30,	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9	1,0	0,0	0,0
Розчин хлориду натрію (0,15 моль/л),мл	1,9	1,8	1,7	1,6	1,5	1,4	1,3	1,2	1,1	1,0	2	2
Реактив С, мл	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
Реактив Е, мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5

В перші десять пробірок внести від 0,1 до 1 мл розчину контрольного білка. Довести вміст всіх пробірок до 2 мл розчином хлориду натрію (0,15 міль/л). Додати в кожну пробірку по 5 мл реактиву С, перемішати й інкубувати при кімнатній температурі 10 в. Потім у всі пробірки внести по 0,5 мл реактиву Е, знову швидко перемішати і інкубувати при кімнатній температурі 30 в.

Протягом цього часу реактив Воліна реагує з мідь-білковим комплексом, розвивається темно-синє забарвлення розчину, інтенсивність якого пропорційна масовій частці білка.

Виміряти на спектрофотометрі значения А λ, залежно від концентрації білка. Отримані результаті дослідження занести до таблиці, за зразком таблиці 6.9..

Таблиця 6.9.

Результати визначення білка за методом Лоурі

№п/п пробірки	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Контрольний розчин білка, мл	0,1	0,2	0,30,	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9	1,0	0,0
А λ, нм

Побудувати графік залежності (калібрувальної кривої) А λ (вісь ординат) від кількості білка в зразку (вісь абсцис).

Контрольні питання

1. Принцип методів спектроскопії.

2. Групи товарів в оцінці якості яких використовують спектральні методи дослідження.

3. Характеристики продовольчих товарів які отримуються при використанні різних спектральних методів.

4. Одиниці вимірювання, які використовуються при спектральних методах дослідження.

5. Використання в товарознавстві продовольчих товарів колориметрії.

6. Використання в товарознавстві продовольчих товарів фотоколориметрії.

7. Використання в товарознавстві продовольчих товарів нефелометрії.

8. Порівняння напрямку використання та чутливості методів спектроскопії.

9.Які методи застосовують для визначення концентрації білка? Дайте характеристику кожному з них.

10. У чому суть принципу роботи спектрофотометра?

11. Як провести вимірювання й побудувати калібрувальні криві для визначення концентрації білка методом Лоурі за поглинанням в УФ-світлі при 280 нм?