3 Образование антибиотиков
Большинство антибиотиков, поступающих в продажу в виде природных соединений или используемых в качестве исходного сырья для получения полусинтетических препаратов, образуются при ферментации в небольшом количестве. Поэтому оптимизация ферментационного процесса, направленная на увеличение образования антибиотика продуцентом, крайне необходима.
Антибиотики представляют собой небольшие молекулы, однако для их синтеза необходимо множество ферментов, объединенных в ферментные системы, как функционально (образование конечного продукта), так и единством регуляции их синтеза. Это важно для понимания физиологии организма-продуцента в особенности при максимализации образования антибиотика в процессе ферментации.
Вторичные метаболиты. Антибиотики являются типичными вторичными метаболитами. Они, вероятно, не играют центральной роли в процессах роста и катаболизма организма и, как правило, образуются после завершения роста популяции. В настоящее время не существует единого мнения о значении вторичных метаболитов для жизнедеятельности микроорганизмов. Однако вряд ли вторичные метаболиты являются «отходами» обмена веществ. Об этом свидетельствует, например, значение нейтральных продуктов, образующихся при брожении, а также достаточно вероятная роль антибиотиков как инструментов антагонизма или веществ, связанных с процессами дифференцировки микроорганизмов.
Первичные метаболиты образуются в период активного роста микроорганизмов и их образование тесно связано с ростом. Таким образом, эффективное образование этих продуктов, как правило, достигается в условиях, оптимальных для роста культуры. Для их получения с успехом применяют непрерывное культивирование. В противоположность этому образование вторичных метаболитов регулируется сложным и не совсем понятным образом, и поэтому проектирование процедуры ферментации часто является достаточно сложным делом. В большинстве случаев для получения вторичных метаболитов непрерывное культивирование не оптимально. Например, продуценты антибиотиков не образуют их до той поры, пока культура не вступает в стационарную фазу. Весьма примечательно, что классические продуценты антибиотиков почвенные микроорганизмы, такие как Streptomyces, Bacillus, миксобактерии и микромицеты, имеют сложный жизненный цикл и, как следствие, проходят различные стадии в процессе жизненного цикла. Последней стадией при периодическом культивировании является спорообразование, коррелирующее с образованием антибиотиков.
Катаболитная репрессия. У многих микроорганизмов, образующих антибиотики, снижается продуктивность в присутствии избытка углерода, в особенности в присутствии, легко утилизируемых соединений, таких как глюкоза. В некоторых исследованиях сообщалось, что уровень активности ферментов, участвующих в синтезе антибиотика, в этих условиях намного ниже. Это предполагает наличие системы регуляции активности ферментов биосинтеза, вероятно, на уровне транскрипции, а не на уровне уже имеющихся ферментов. Этот факт весьма напоминает феномен катаболитной репрессии, изученный на клетках E. coli. Известно, например, что в присутствии хорошо усваиваемого источника углерода, такого как глюкоза, в клетках E. coli подавляется синтез ферментов деградации менее предпочтительного источника углерода, например, лактозы. Таким образом, можно представить, что почвенный микроорганизм, продуцирующий антибиотик, нуждается в его образовании и убивает конкурента только при недостатке питательных веществ в окружающей среде, а катаболитная репрессия является весьма полезным приспособлением для этой цели. Поскольку феномен катаболитной репрессии существует и в процессе биотехнологического производства антибиотиков, его преодоление возможно при условии, что источник углерода добавляется в среду культивирования небольшими порциями, чтобы существенно не увеличивать его концентрацию в любой данный момент времени. В качестве альтернативы в борьбе с катаболитной репрессией весьма привлекательны попытки получения мутантов, у которых образование антибиотиков слабо зависит от присутствия избытка источника углерода.
Репрессия источниками азота и фосфатом. Во многих случаях присутствие соединений, являющихся источником азота и фосфора в ферментационной среде, несколько снижает образование антибиотиков. Экологическая выгода такой регуляции, вероятно, подобна выгоде от катаболитной репрессии. Фосфат ингибирует транскрипцию некоторых генов синтеза антибиотиков. В клетках микроорганизмов, чувствительных к регуляции азотом или фосфором, необходима или очень тщательная регуляция концентраций этих соединений в течение всей ферментации или необходимо пытаться получить мутанты, менее чувствительные к этим регуляторным процессам.
Регуляция синтеза при помощи обратной связи. Есть основания предполагать, что сами антибиотики как конечные продукты могут осуществлять регуляцию своего синтеза при помощи отрицательной обратной связи. Данные, подтверждающие это предположение, были получены в экспериментах, в которых пенициллин, добавленный к культуре сверхпродуцента пенициллинсинтезирующего гриба, ингибировал синтез антибиотика.
Регуляция синтеза антибиотика при помощи обратной связи дает возможность увеличить его образование стимуляцией экскреции антибиотика и таким образом снизить его внутриклеточную концентрацию. Многообещающие результаты были получены при стимуляции выхода антибиотика с помощью полиеновых антибиотиков, но при этом появилась новая проблема отделения синтезируемого продуцентом антибиотика от экзогенных полиенов. Возможно, метод увеличения проницаемости клеточной мембраны без добавления экзогенных препаратов, используемый в ряде других биотехнологий, например, при получении аминокислот, может быть использован и для увеличения образования антибиотиков.
Эффекты предшественников. Вторичные метаболиты синтезируются из первичных метаболитов. Для эффективного образования антибиотиков необходимо постоянное наличие их предшественников. Во многих случаях образование этих предшественников регулируется известными механизмами. В качестве примера того, как регулируется обеспечение предшественниками и как предшественники действуют на образование антибиотиков, можно привести влияние условий культивирования на образование ос-аминоадипиновой кислоты предшественника биосинтеза пенициллина. У грибов -аминоадипиновая кислота – предшественник биосинтеза лизина. Поскольку лизин является конечным продуктом ферментной системы биосинтеза, высокий уровень лизина в среде подавляет биосинтез ретроингибированием первого фермента пути биосинтеза лизина, (по принципу обратной связи). Это сопровождается уменьшением количества всех промежуточных продуктов пути биосинтеза, включая ос-аминоадипиновую кислоту. Таким образом, избыток лизина сильно ингибирует образование пенициллина P. chrysogenum. Удивительной противоположностью является стимулирующее влияние избытка лизина на образование цефамицина С Streptomyces. Это происходит вследствие того, что ос-аминоадипиновая кислота синтезируется у прокариот совершенно отличным путем (рисунок 1), в котором лизин является ее предшественником, т.е. одни и те же вторичные метаболиты, используемые в качестве исходного материала, у разных организмов могут быть получены различными путями, которые регулируются различными регуляторными механизмами.
-Кетоглутарат
Аспартат
Ас-СоА
Аспартат
полуальдегид
Треонин
Метионин
Изолейцин
Гомосерин
-Аминоадипинат
Лизин
-Аминоадипинат
β-Лактамы
β-Лактамы
Лизин
Грибы |
Прокариоты |
Рисунок 1 – Пути биосинтеза -аминоадипиновой кислоты у грибов и прокариотов
Наряду с -аминоадипиновой кислотой пенициллин или цефалоспорин нуждаются в цистеине и валине. Путь биосинтеза цистеина различается у различных видов и даже у различных штаммов. У P. chrysogenum большая часть атомов серы включается в цистеин из неорганического сульфата среды.
У С. acremonium – продуцента цефалоспорина – источником большей части серы цистеина является метионин, образующийся при помощи реакции транссульфирования (рисунок 2).
Метионин
S-аденозилметионин
S-аденозилгомосерин
Гомосерин
С.
acremonium
Серин
Цистатион
Цистатионин--лиаза
цистеин
Серин+Ас-СоА
P.
chrysogenum
H2S
SO4
Рисунок 2 – Пути биосинтеза цистеина, используемого в синтезе β-лактама. У С. acremonium цистеин образуется путем трансульфирования метионина через цистатионин (непрерывные стрелки), у P. chrysogenum – из сульфата (прерывистые стрелки)
В этом случае добавление метионина к среде сильно стимулирует образование цефалоспорина по меньшей мере частично за счет увеличения количества цистеина. При исследовании некоторых штаммов, образующих большие количества цефалоспорина С была обнаружена корреляция между уровнем цистатионин--лиазы – фермента, участвующего в образовании цистеина, и выходом антибиотика.
Однако механизм действия метионина является более сложным, чем это принято считать. Добавление норлейцина, аналога метионина, также стимулирует синтез цефалоспорина С у C. acremonium, хотя норлейцин, очевидно, не является предшественником цистеина. Некоторые исследования наводят на мысль, что уровень ферментов синтеза -лактамов повышается, когда клетки растут в присутствии метионина или норлейцина потому, что эти соединения могут действовать как общерегуляторные молекулы для механизма биосинтеза цефалоспорина.
Условия ферментации. Большинство процессов ферментации протекает в две стадии. Исходным материалом первой стадии являются споры определенного штамма, так как образование антибиотиков является нестабильным свойством культуры, которое может быть легко утеряно, если культуру сохраняют постоянно растущей путем серийных пересевов. Микроорганизмы культивируют глубинным способом в условиях достаточного аэрирования и источников питания так, что они достигают максимальной плотности в короткое время. На второй стадии, когда культура переходит в стационарную фазу или прекращает рост, начинается образование антибиотиков. Концентрация ключевых компонентов питания, таких как источники углерода, фосфата и азота должны внимательно контролироваться.