3.5 Влияние различных факторов на жизнедеятельность мо

Хлор, йод, бром, фтор. Роль галогенов в жизни микробов и их биохимической деятельности неизвестна. Показано, что эти элементы входят в состав некоторых тетрациклиновых антибиотиков и хлорамфеникола. Нередко хлор и бром выступают в качестве антагонистов в процессе биосинтеза названных антибиотиков.

Вода. Известно, что вода играет чрезвычайно важную роль во всех жизненных процессах, хотя сама по себе она не является питательным веществом или источником энергии. Она входит в живую клетку как важнейшая ее часть и составляет единую систему с элементами клетки. Вода – растворитель, способствующий проникновению в клетку необходимых веществ и выводу из клетки продуктов обмена. В клетках вода находится не только в виде чистого растворителя, но также в виде соединений с углеводами, белками и другими веществами, тесно взаимодействуя с макромолекулами клетки. Гидратирование и дегидратирование органических молекул – важнейший этап в превращении химических компонентов протоплазмы.

Поступление воды в бактериальную клетку регулируется цито-плазматической мембраной.

Неизвестно, какую роль в метаболизме микроорганизмов имеют связанная вода, тяжелая вода и различные полимеры воды (Н₂О; (Н₂О)₂; (Н₂О)₃ и т. д.). В литературе имеются данные о том, что связанная вода влияет на устойчивость бактериальных спор к действию неблагоприятных условий. Установлено, что скорость роста Е. coli более низкая в среде, приготовленной на свежей дистиллированной воде (преимущественно моно- и дигидрол), чем в среде, приготовленной на воде свежерастопленного льда (преимущественно тригидрол).

Высокополимеризированные молекулы воды являются весьма важными во многих физиологических процессах. Этим самым, по мнению некоторых авторов, объясняется богатство микрофлоры в Северном океане.

Сведения о влиянии воды различных форм на процесс антибио-тикообразования у микроорганизмов отсутствуют.

Влияние рН среды. Активная кислотность (рН) среды оказывает существенное влияние на развитие микроорганизмов, на характер их обмена и, следовательно, на процесс образования антибиотиков. Влияние рН может проявляться как непосредственное воздействие ионов водорода или гидроксильных ионов на клетку или как косвенное действие через изменение степени диссоциации веществ субстрата. Изменения рН среды заметно сказываются на активности ферментов микроорганизмов, состоянии промежуточных продуктов, их диссоциации, растворимости и т.д. Таким образом, изменение активной кислотности среды оказывает значительное влияние на выход конечных продуктов метаболизма микроорганизмов.

Перед посевом микроорганизма, в первую очередь необходимо проверить значение рН среды.

Многие бактериальные организмы, образующие антибиотики, развиваются лучше при нейтральном значении исходной активной кислотности среды (рН около 7,0). Хотя некоторые бактерии, например молочнокислые стрептококки, синтезирующие низин, развиваются в среде при рН, равном от 5,5до 6,0.

Большинство актиномицетов-антагонистов хорошо развивается в тех случаях, когда начальное значение рН среды находится в пределах от 6,7 до 7,8. В подавляющем большинстве случаев актиномицеты не развиваются при уровне рН ниже 4.

В последние годы выделены ацидофильные стрептомицеты, оптимум рН развития которых лежит в пределах от 3,5 до 6,5.

Грибы, как правило, могут развиваться при слабокислой начальной реакции среды (рН равно от 4,5 до 5).

В ходе развития организмов происходит изменение рН среды, которое зависит как от состава субстрата, так и от физиологических особенностей самого организма.

Иногда можно заранее сказать, в какую сторону будет идти изменение рН субстрата при развитии на нем того или иного микроорганизма. Так, если в среде в качестве единственного источника азота присутствует физиологически кислая соль (например, аммоний сернокислый) и отсутствуют в достаточном количестве, например, ионы кальция, то при развитии любых организмов, использующих азот аммония, будет идти довольно сильное подкисление субстрата. И, наоборот, если в среде имеется в качестве единственного источника азота физиологически щелочная соль (например, KNO₃), то при использовании азота этого соединения будет идти подщелачивание субстрата. Среда, как правило, будет подщелачиваться и в том случае, если организм при развитии в качестве источников углерода активно использует соли органических кислот.

Следует отметить, что как сильное подкисление, так и значительное подщелачивание субстрата может приостановить развитие организма, прекратить процесс образования антибиотика.

Следовательно, составлять среды надо с таким расчетом, чтобы при развитии организмов в них рН среды по возможности остался в пределах нормы, необходимой для развития микроба и биосинтеза антибиотического вещества.

Температура. Для нормального развития микроорганизмов и образования ими антибиотических веществ необходима определенная температура.

Различные группы микроорганизмов для своего развития с образованием антибиотиков нуждаются в различных оптимальных температурах. Для большинства бактериальных организмов температурный оптимум развития лежит в границах от 30 °С до 37 °С. Для B. brevis – продуцента грамицидина С – оптимальной температурой для развития и биосинтеза антибиотика является 40 °С. Хотя этот же организм может нормально развиваться и синтезировать антибиотик и при температуре 28 °С, при этом лишь максимум накопления грамицидина запаздывает примерно на 24 часа. Актиномицеты – продуценты антибиотиков, как правило, культивируются при температуре от 26 °С до 30 °С, хотя некоторые виды стрептомицетов могут развиваться как при пониженных температурах (от 0 °С до 18° С), так и при повышенных (от 55 °С до 60 °С). Для большинства плесневых грибов оптимальной признана температура от 25 °С до 28 °С. Для термофильных микроорганизмов температурный оптимум лежит в пределах от 50 °С до 65 °С.

Отклонение температуры развития в ту или другую сторону обычно вызывает замедление роста микроорганизма и снижение выхода антибиотика. Обусловлено это тем, что температура оказывает существенное влияние на активность ферментов продуцентов антибиотиков, активность транспортных систем и на другие важные физиолого-биохимические функции микробной клетки. Так, транспорт нейтральных аминокислот в клетки актиномицетов осуществляется стереоспецифической транспортной системой, единой для всех этих аминокислот. Поступление в клетки актиномицета L-валина – основного компонента биосинтеза остатков L-метил-L-валина и D-валина в полипептидных цепях актиномицинов – происходит с помощью системы активного транспорта. Активность этой системы заметно изменяется в зависимости от температуры, проявляя максимум в пределах от 18 °С до 23 °С.

Аэрация – один из существенных факторов условий культивирования, определяющих характер развития микроорганизмов и их биосинтетическую активность.

Большинство изученных продуцентов антибиотиков – аэробы, а потому для их оптимального развития необходима определенная степень аэрации среды. Известно, что степень аэрации служит одним из обычных способов изменения окислительно-восстановительных условий, которые являются основным средством изменения процессов обмена веществ у микроорганизмов, в том числе и процессов, связанных с образованием антибиотиков.

Аэрирование культур осуществляется в основном тремя способами:

а) путем продувания определенного объема воздуха через культуральную жидкость с одновременным ее перемешиванием или без него;

б) путем встряхивания культуральной жидкости, находящейся в колбах, на специальных аппаратах;

в) путем выращивания микроорганизмов в виде пленки на поверхности питательной среды.

Наиболее совершенным методом аэрации следует признать метод продувания воздуха через культуральную жидкость с одновременным ее перемешиванием. В этом случае степень аэрации культуры можно учитывать количественно.

Степенью аэрации культуры, равной единице, является такая аэрация, при которой через определенный объем среды за одну минуту продувается такой же объем воздуха. Иными словами, степень аэрации равна единице, если через 100 л культуральной среды пропускается за одну минуту 100 л воздуха. Если степень аэрации равна 0,5, то это означает, что через 100 л культуральной жидкости пропускается в минуту 50 л воздуха.

Установлено, что если степень аэрации близка к единице, происходит максимальное накопление ряда антибиотиков (пенициллина, стрептомицина и др.). Уменьшение степени аэрации среды или ее чрезмерное увеличение приводит к уменьшению выхода антибиотика.

Интенсивность аэрации определяется скоростью поступления в реакцию кислорода, растворенного в единице объема среды. Для количественных результатов определения растворенного в среде кислорода часто используют специальные датчики. Наиболее удобны платиновые электроды, защищенные от окружающей среды газопроницаемой пленкой.

Применение сульфитного метода при определении интенсивности аэрации позволяет получить лишь сравнительную оценку, но не дает данных по количественному содержанию кислорода в субстрате.

Насыщение культуральной среды кислородом зависит не только от количества воздуха, пропускаемого через единицу объема среды, но и от способа перемешивания, скорости работы мешалок, состава среды и концентрации растворенных в ней веществ, а также от температуры культивирования.

Перемешивание культуральной жидкости способствует равно­мерному распределению питательных веществ и перемещению их к клеткам микроорганизма. Перемешивание обеспечивает также удаление с поверхности клеток продуктов обмена и лизиса клеток, более равномерное распределение кислорода в культуральной жидкости. Все это улучшает условия развития микроорганизмов и повышает их физиолого-биологическую активность, связанную с биосинтезом антибиотиков.

При культивировании микроорганизмов в колбах на качалках степень аэрации среды зависит от числа оборотов качалки в минуту и объема культуральной жидкости: чем меньше объем среды в колбе, тем выше ее аэрация. Поглощение кислорода средой увеличивается, если вместо обычных конических колб применяются колбы с отбойниками

Степень аэрации культур, выращиваемых в виде пленки на поверхности жидкой среды, можно регулировать изменением площади развития организма и толщины слоя жидкости. С увеличением площади развития организма и уменьшением слоя жидкости аэрация культуры будет большей.

Интенсивность аэрации культуры продуцента того или иного антибиотика должна коррелировать с составом среды. С повышением концентрации компонентов среды для развития продуцентов ряда антибиотиков (пенициллина, стрептомицина, новобиоцина, хлортетрациклина, окситетрациклина и др.) интенсивность аэрации культуры необходимо повышать.

Изменения условий аэрации приводит не только к изменению процесса обеспечения продуцента антибиотика кислородом, удалению из среды углекислого газа и других летучих продуктов метаболизма, но и к изменению характера обмена веществ организма. Так, например, в условиях ухудшения аэрации среды для развития S. aureofaciens в культуральной жидкости повышается содержание летучих органических кислот и снижается биосинтез тетрациклина.

Следовательно, только при учете всех особенностей культивиро­вания организма, при изучении влияния различных компонентов субстрата, физико-химических и физических факторов среды можно определить способность микроорганизма образовывать антибиотическое вещество. Создавая организму разнообразные условия культивирования, мы тем самым определяя, какие из них наиболее благоприятны для выявления потенциальных возможностей биосинтеза антибиотиков.