17. Возбудитель бруцеллеза. Морфология, культивирование, биохимические свойства. Анти­ генная структура. Патогенез. Микробиологическая диагностика. Иммунитет. Биопрепара­ ты.

Br. melitensis (овец и коз)

Br. abortus (крупного рогатого скота)

Br. suis (свиней)

Br. canis (инфекционного эпидидимита баранов)

Бруцеллез - хроническая инфекционная болезнь всех млекопитающих, в том числе и человека. У собак болезнь протекает в виде периодических лихорадок (ремитирующего типа), а также патологий со стороны репродуктивных органов. Эта болезнь у собак крайне плохо изучена и часто проходит под другим диагнозом. Она представляет очень большую опасность для владельцев животного.

Палочки, кокки; ---+;

МППБ, МППГГА, ПГГА, ПГГБ;

Слабо; H₂S; аборт.плод, парен.орг, л/у, молоко. кост.мозг ; 1)микр 2)посев 3)биопроба 4)

Патогенез и факторы вирулентности:

возбудитель в организм проникает алиментарным и половыми путями;

бруцеллы вначале размножаются в ближайших лимфатических узлах, далее проникают во внутренние органы, инфекция принимает генерализованный характер. Наиболее благоприятную среду для размножения бруцеллы находят в беременной матке, что приводит к эндометриту, нарушению питания плода и аборту;

факторами вирулентности у бруцелл являются эндотоксины и ферменты патогенности – гиалуронидаза, каталаза, уреаза

По морфологическим и культуральным свойствам бруцеллы всех видов не отличаются одна от другой. Это мелкие бактерии, размером от 0,3 до 0,6 мкм для кокковых и 0,6—2,5 мкм для палочковидных форм, неподвижны, спор не образуют, грамотрицательны, растут на обычных питательных средах при 36—38 °С (рН 6,8—7,2).

Прямые солнечные лучи убивают бруцелл за 4,5 ч. В почве они сохраняют жизнеспособность до 100 дн., в воде до 114 дн. В естественных условиях при низкой температуре могут выживать до 160 дн. Высокая температура и дезинфицирующие растворы на бруцелл действуют губительно. В молоке при нагревании до 70 °С они погибают за 10 мин, при 80—85°С — за 5 мин, а при кипячении — практически мгновенно.

1. ВОЗБУДИТЕЛЬ БОЛЕЗНИ

Возбудителем бруцеллеза выступают мелкие бактерии рода Brucella, относящиеся к различным видам. Род Brucella представляет собой компактную, достаточно обособленную генетическую группу.

Род Brucella по систематике Берги относится к родам с неясным систематическим положением. Род включает шесть видов: Brmelitensis, Br.abortus, Br.suis, Br.ovis, Br.neotomae и Br.canis, которые различаются, в основном, по культуралышм и биохимическим свойствам.

Возбудитель представляет собой короткую грамотрицателькую палочку (или коккобациллу) размером 0,5-0,7x0,6-1,5 мкм. Микробная клетка неподвижна, спор и капсул не образует.

У собак в качестве возбудителя болезни могут выступать представители почти всех видов, однако для бруцелл вида canis собаки являются основными хозяевами. Поэтому преимущественным возбудителем бруцеллеза у собак считается Br.canis. Этот же вид может вызывать бруцеллез и у человека, с классической для этой болезни клиникой (лихорадка, артриты,головные боли и т.д.) [1]. Интересно, что бруцеллез у собак, вызываемый Br.canis, регистрируется даже в тех странах, где бруцеллеза других видов животных не встречается (Англия, Германия, Япония, Чехословакия) [2].

Строение бруцелл типично для большинства грамотрицательных бактерий. В полной мере это относится и к наиболее активной в иммунологическом отношении клеточной стенке [3].

Стенка микробной клетки состоит из трех основных для этих бактерий' слоев: цитоплазматической мембраны клетки, пептидогликанового слоя, создающего жесткий остов, и наружной мембраны (см. рисунок 9)

Считается, что болезнь вызывает возбудитель, который существует в двух основных формах - гладкой S-форме и шероховатой R-форме. Они различаются между собой по строению клеток и характеру метаболизма. Главным же антигенным отличием является отсутствие у R-вариантов полисахаридной цепи S-эндотоксина, где антигенными детерминантами, определяющими бруцеллезную специфичность, являются структуры алъфа-2-маннопиранозы.

Некоторые виды бруцелл (Br.melitensis,Br.abortus,Br.suis) изначально находятся в S-форме, но при различных неблагоприятных условиях или при паразитировании в нетипичном хозяине могут легко диссоциировать в R-форму. В соответствующих благоприятных условиях они снова реверсируют в S- форму. (Переход бруцелл из S-формы в R носит название диссоциации, а из R в S-реверсии).

Другие виды Br.ovis и Br.canis постоянно находятся в R-форме (хотя и имеются единичные сообщения об их переходе в S-форму). В случаях, когда возбудителем бруцеллеза у собак будут являться бруцеллы первых трех видов, они будут находиться в S-форме или в R-форме, так как собака для них нетипичный хозяин. Если возбудителем является Br.canis то возбудитель находится только в R-форме. .

Внимание читателя на антигенных особенностях возбудителя, связанных с диссоциацией, акцентировано неслучайно. В нашей стране диагностика бруцеллеза у собак проводится только с диагностикумом выявляющим заражение классическими S-вариантами бруцелл. Практически все R-варианты возбудителя не определяются (хотя и разработано немало R-диагностикумов), а следовательно и болезнь не диагностируется.

Бруцеллы относятся к микроорганизмам, которые мало устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды. Нагревание до 60 °С убивает их за

30-40 минут, 80 °С - за 5 минут, кипячение - моментально. Они неустойчивы к фенолу, спирту, формалину, хлорамину и другим дезинфицирующим веществам. Однако в фекалиях, моче и других органических материалах при низкой температуре могут сохраняться до трех-четырех месяцев. Прямой солнечный свет действует на них губительно.

2. ПАТОГЕНЕЗ

2.1. Особенности и предрасположенность.

К бруцеллезу восприимчивы все собаки, независимо от породы, пола и возраста. Отмечена более выраженная чувствительность у самок в период беременности.

2.2. Динамика патогенеза.

Возбудитель бруцеллеза может проникать в организм разными путями: через респираторный тракт, через желудочно-кишечный тракт, при половом контакте и даже через неповрежденную кожу. Установлено, что бруцеллы продуцируют ферменты гиалуронидазу и нейраминидазу, которые разрушают мукополисахаридный остов эпителиальных клеток и помогают им проникать через барьеры кожных и слизистых оболочек [5]. Тем не менее, видимо основным путем проникновения бруцелл в организм собак следует считать пероральный, т.е. через желудочно-кишечный тракт. Это происходит при поедании инфицированной пищи (мяса, молока) или при облизывании влагалищных выделений (при обнюхивании других собак).

Прошедший через эпителиальный барьер, возбудитель проникает в кровь или лимфу и затем попадает в близлежащие лимфоузлы. В первые же часы после проникновения в организм возбудитель подвергается фагоцитированию макрофагами и нейтрофилами. Бруцеллы имеют очень интересную особенность. Они способны не только противостоять бактерицидным системам фагоцитов, но и длительно выживать внутри фагоцита, что в конечном итоге приводит его к разрушению. Более того, возбудитель "стремится" как можно скорее быть захваченным фагоцитом и укрыться за его мембранами, поскольку бактерицидные ферменты и белки крови (лизоцим, комплемент) очень губительны для микробных клеток бруцелл.

Находясь внутри фагоцита, бруцеллы защищены мембранами этих клеток от антибиотиков и других препаратов, которые используются при лечении бруцеллеза. Именно поэтому бруцеллез очень трудно излечить, поскольку лекарственные препараты плохо преодолевают клеточные мембраны [3].

Но почему бруцеллы способны выживать внутри фагоцитировавшего их макрофага? Ведь согласно иммунологической программе, заложенной в организме, возбудитель должен быть убит (см. гл.1). Автор многие годы работал над этой проблемой. Согласно полученным результатам, а также некоторым литературным данным, этот процесс можно представить следующим образом.

При фагоцитозе микробной клетки бруцелл на неё воздействуют активные формы кислорода и перекись водорода. Но бруцеллы легко выдерживают этот "натиск", поскольку их клетки содержат большое количество фермента каталазы, которая нейтрализует перекись водорода. Поэтому в фагосому оказывается заключена не убитая, а живая клетка бруцелл. В дальнейшем возбудитель секретирует некое вещество (макрофаготоксин), которое, воздействуя на регуляторные системы фагоцита, увеличивает в нем содержание циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) и снижает уровень циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Таким образом, резко (в 8-10 раз) увеличивается индекс цАМФ/цГМФ в макрофаге, что через каскад сложных реакций приводит, к снижению подвижности лизосом. Поэтому процессы сближения лизосом и фагосомы, а также их слияния резко подавляется. "Токсическая

триада" (миелопероксидаза-НгОа-галоген), которая очень губительна для бруцелл, в этом случае не образуется.

Таким образом возбудитель остается жизнеспособным внутри фагоцита и, паразитируя, нарушает метаболизм этой клетки. В результате фагоцит погибает и лизируется. Вышедший во внеклеточное пространство возбудитель фагоцитируется новыми клетками и процесс начинается снова.

Вместе с поглотившими их клетками бруцеллы разносятся во все паренхиматозные органы (печень, селезенку, костный мозг и т.д.) и лимфоузлы. Но наибольший тропизм возбудитель имеет к половым органам (семенникам, придаткам семенника, тканям матки, особенно в состоянии беременности). Развиваются множественные воспалительные явления, которые носят хронический характер с периодическими обострениями (ремитирующий тип). Немалую роль в развитии патологии на тканевом уровне играют и реакции ГЗТ. Длительное течение болезни сопровождается серозно-продуктивным воспалением паренхиматозных органов, что приводит к атрофии паренхимы, склерозу стромы и множественным фиброзным отложениям.

2.3. Взаимоотношения с системой иммунитета.

Механизмы иммунитета, которые обеспечивают специфическую невосприимчивость организма к бруцеллезу, пока не известны. Возможно, это какие-то особые, неизвестные пока типы реакций . Установлено, однако, что если бруцеллы могут нарушать бактерицидные процессы в макрофагах восприимчивых животных, то в таких же макрофагах, полученных от иммунизированных животных сделать этого возбудитель уже не в состоянии. В этом случае бруцеллы очень быстро погибают при фагоцитозе [6].

Нам удалось установить, что такой же эффект наблюдается и у лабораторных животных при выработке у них иммунитета к макрофаготоксину (см. 2.2.). Животные, которым одно- или двухкратно вводили чистый макрофаготоксин, становились невосприимчивыми к экспериментальному заражению бруцеллезом.

Таким образом, в результате вакцинации организм животного приобретает повышенную устойчивость к последующему заражению, т.е. становится иммунным. Однако напряженность такого иммунитета невелика и доза возбудителя, на два порядка превышающая минимальную заражающую (ИД/100), легко прорывает иммунитет, создаваемый любой современной вакциной. Высказывалось даже мнение, что при бруцеллезе вообще нет специфического иммунитета.

По нашим данным, эта особенность связана со свойствами некоторых факторов патогенности бруцелл, имеющих молекулярную структуру очень близкую к молекулярной структуре веществ, свойственных для самого организма хозяина.

Вместе с тем, после проникновения возбудителя в организм уже на 5-6 день могут быть зарегистрированы специфические антитела. В основном, антитела вырабатываются на бруцеллезные эндотоксины (липополисахариды) и направлены против S- или R-эндотоксинов (см. рис. 9). Эти антигены (эндотоксины) и специфические антитела к ним (гипериммунные сыворотки) используются для диагностики бруцеллеза у животных и при определении вида возбудителя. Но лечебным эффектом гипериммунная сыворотка не обладает и титр таких антител в организме не коррелирует с состоянием специфическом невосприимчивости к бруцеллезу.

Таким образом, при воздействии бруцелл, у животных формируется иммунологическая невосприимчивость к бруцеллезу, хотя сила этой реакции

(напряженность иммунитета) относительно невелика и повторное заражение не исключено.

4. КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ

Бруцеллез у собак протекает обычно хронически и очень часто бессимтомно. В отдельных случаях при таком вялотекущем заболевании у кобелей могут развиваться поражения половых органов: эпидидимиты и орхиты с пролиферацией лимфо-гистиоцитарных элементов. В более тяжелых случаях разрушается паренхима простаты и семенных канальцев семенников и развивается асперматогенез. То есть животные становятся бесплодными.

У сук основные патологические реакции развиваются во время щенности. При этом собаки могут абортировать на 30-50 день щенности или рождать мертвое потомство. После этого у них длительное время продолжаются воспалительные процессы в матке. Плодные воды и выделения из матки содержат огромные количества возбудителя и животное в этот период представляет собой опасный источник заражения и прежде всего для своих владельцев.

Кроме поражений половых органов у собак иногда могут наблюдаться увеличение лимфоузлов. Очень редко наблюдают лихорадку ремитирующего типа. В литературе встречаются описания артритов у собак при бруцеллезе.

5. ДИАГНОСТИКА

Диагностика бруцеллеза должна строиться исключительно на серологических реакциях. Причем в качестве диагностикумов должны быть использованы препараты, позволяющие выявлять антитела как к S- так и к R-антигенам возбудителя.

Отдельный вопрос в диагностике бруцеллеза составляет дифференциация (отличие) реакций на бруцеллез и иерсиниоз, возбудитель которого может вызывать небольшое расстройство деятельности желудочно-кишечного тракта.

Проблема состоит в том, что у некоторых сероваров бактерий Iersinia cntcroeolitica эндотоксин имеет почти идентичное строение с S-эндотоксином бруцелл. Благодаря этому совпадению при паразитировании иерешшй у животных им мохет быть ошибочно поставлен диагноз на бруцеллез. Существуют специальные дифференциальные тесты, позволяющие довольно достоверно различать бруцеллез и иерсинеоз.

Методы диагностики:

материал для исследования: абортированный плод с оболочками, желудок, печень, почки плода, молоко и др.

Микроскопия:

методы окраски: по Граму, по Козловскому;

микрокартина: мелкие коккобактерии (0,3-0,6мкм ) или мелкие палочки (0,6-2,5 мкм),располагаются одиночно, парами и небольшими группами);

грамотрицательные;

спор не образуют;

капсулу не образуют;

неподвижные.

Культивирование:

посев на питательные среды – мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночно-глюкозо-глицериновый бульон и агар (МГГБ и МГГА) с 10%-ной глюкозой и 2-3% - ным глицерином.

особенности выделения возбудителя:

микроаэрофилы;

выращивают в атмосфере 10-15% СО2 (Br.bovis, Br.ovis в первой генерации);

остальные виды бруцелл – аэробы;

оптимальная температура 37oС;

срок культивирования от 15 до 30 дн.

культуральные свойства:

На жидких средах – равномерное помутнение, пристеночное кольцо, незначительный осадок;

На плотных средах – мелкие, прозрачные с ровным краем колонии.

биохимические свойства:

сахаролитические свойства выражены слабо;

протеолитические свойства – молоко не свертывают, желатин не разжижают, сероводород образуют Br. suis в меньшей степени Br. abortus.

РА, РСК

Биопроба: заражают подкожно морских свинок, белых мышей.