6. Инфекционная аллергия и методы ее выявления.

Повышенную чувствительность к аллергенам (антигенам) патогенных микробов и продуктам их жизнедеятельности называют инфекционной аллергией. Она играет важную роль в патогенезе и развитии таких инфекционных болезней, как туберкулез, бруцеллез, сап, аспергиллез и др. При выздоровлении животного гиперергическое состояние еще долго сохраняется. Специфичность инфекционных аллергических реакций позволяет использовать их с диагностической целью. Промышленным способом на биофабриках готовят различные аллергены — туберкулин, маллеин, бруцеллогидролизат, тулярин и др.

Инфекционная аллергия - это состояние повышенной чувствительности к повторному контакту с микроорганизмами или продуктами их жизнедеятельности. Развивается при многих инфекционных болезнях; играет большую роль в их патогенезе и сохраняется длительное время после выздоровления. Инфекционная аллергия наблюдается при туберкулезе, бруцеллезе, сифилисе и др.

Специфичность реакций при инфекционной аллергии используют для диагностики многих инфекционных болезней (туберкулез, бруцеллез, туляремия и др.) - применяют кожно-аллергические пробы. Внутрикожно или накожно вводят очень небольшие количества аллергенов - фильтраты или лизаты культур, взвеси бактерий, убитых нагреванием или химическими веществами и т. п.

При повышенной чувствительности в месте введения аллергена возникает реакция: покраснение, припухлость, болезненность. Иногда развиваются и общие реакции: слабость, недомогание, обострение общего процесса (например, после введения туберкулина при туберкулезе).

7. Реакции агглютинации.

Реакция агглютинации бактерий протекает в две фазы. Первая, специфическая, невидимая фаза реакции агглютинации состоит во взаимодействии антител с антигенными детерминантами, расположенными на поверхности бактерий и других корпускулярных частиц. Вторая, видимая, фаза реакции, протекающая лишь в присутствии электролита в среде, заключается в склеивании и оседании на дно пробирки иммунных комплексов в виде хлопьев или зерен, видимых невооруженным глазом.

Кроме специфической агглютинации бактерий, вызванной антителами, возможна спонтанная агглютинация (в отсутствие иммунной сыворотки). Спонтанную агглютинацию дают R-фор-мы бактерий, не образующие гомогенной взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия и осаждающиеся в виде клеточных агрегатов. При кислой реакции среды в результате снятия одноименного заряда с поверхности бактериальных клеток в изоэлектрической зоне происходит склеивание — наступает «кислотная» агглютинация.

В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний реакцию агглютинации очень часто применяют как для идентификации видов и сероваров бактерий с помощью диагностических агглютинирующих сывороток, так и для определения присутствия антител в сыворотке больного по известным антигенам (диагностикумам), т. е. для серодиагностики.

Реакция агглютинации.

Сущность реакции заключается во взаимодействии антител-агглютинов и антигена-агглютиногена, в результате которого образуется комплекс АГ+АТ, выпадающий в осадок-агглютинат.

Готовят сыворотку, разводят стандартный антиген физ раствором 1:10 и ставят реакцию. В 4-х пробирках делают разведения Ат –0,5мл 1:50,1:100,1:200, 1:400, и приливают в каждую по 0,5мл АГ 1:10. Пробирки встряхивают и ставят в термостат на 16-20 часов, потом в течении часа при комнатной t. Учет микроскопически.

Оценка реакции

++++ полное осветление, зонтик

+++ жидкость слегка опалесцирует, зонтик

++ жидкость мутная, зонтик слабо выраж.- реакция «+»

+ жидкость мутная, осадок в виде точки - реакция «-»

Можно ставит РА пластинчатым (капельным) методом.

«+» - первые 5 мин видны крупинки и хлопья минего цвета, жидкость просветляется.

«-» - смесь гомогенна.

Реакция латекс-агглютинации

Реакция латекс-агглютинации является одним из видов реакции агглютинации, в которой в качестве носителя антигена или антитела используются синтетические полимерные частицы - латексы.

Эта реакция применяется с целью: 1) обнаружения присутствия антител в сыворотке крови обследуемых лиц; 2) идентификации возбудителя заболевания.

Для приготовления антигенного латексного диагностикума растворимые мелкодисперсные антигены бактериальной клетки белковой или полисахаридной природы адсорбируют на поверхности окрашенных частиц инертного монодисперсного латекса. Такие нагруженные бактериальным антигеном латексные частицы склеиваются под действием иммунной сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, что приводит к образованию характерного осадка - тонкой пленки с неровными краями ("зонтик").

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РПГА).

Данную реакцию относят к серологической реакции осадочного типа. В ней используют растворимые микробные антигены, сорбированные на эритроцитах как носителях (антигенный диагностикум), или сорбированные на эритроцитах антитела известной иммунной сыворотки (антительный диагностикум). Антигенные диагностикумы применяют для серологичечкой диагностики, антительные – для обнаружения антигенов в исследуемом материале. РНГА на стекле применяют для диагностики пуллороза – тифа птиц (качественная кровекапельная реакция непрямой гемагглютинации), при положительной реакции выпадает в течение двух минут в смеси крови с антигеном хлопья коричневого осадка. Пробирочная РНГА рекомендована для серологической диагностики многих инфекционных болезней (сальмонеллезы, лептоспироз, трихомоноз и др.).

РА на стекле.

При этом варианте РА испытуемыми могут быть как сыворотка, так и антиген, но чаще всего этот вариант используют для идентификации микроорганизмов.

1. Для идентификации микроорганзма (м/о) на обезжиренное предметное стекло наносят раздельно каплю известной агглютинирующей сыворотки, например сальмонелиозной, и каплю физиологического раствора (контроль). Затем бактериологической петлей берут бактериальную массу изучаемой культуры из колонии в чашке Петри или с поверхности скошенного МПА в пробирке и суспендируют раздельно в иммунной сыворотке и физиологическом растворе до получения гомогенной взвеси. Результат учитывают через 2…4 мин.

Учет результатов: в контрольной пробе изменения должны отсутствовать. При специфическом соответствии культуры бактерий иммунной сыворотке появляются хлопья агглютината (положительный результат), в случае отсутствия феномена агглютинации делают заключение о том, что исследуемая культура бактерий не соответствует иммунной сыворотке.

2. Обнаружение аниттел в исследуемой сыворотке крови рассмотрим на примере роз-бенгал пробы, применяемой при серодиагностике бруцеллеза. На предметное стекло наносят 0,3 мл исследуемой сыворотки крови животного и 0,03 мл бруцеллезного антигена (окрашенные розовым-бенгальским клетки бруцелл). Компоненты тщательно перемешивают покачиванием стекла и через 4 мин учитывают результат.

Учет результатов: при положительной реакции появляются розовые хлопья агглютината. Серологическую реакцию подобного типа относят к качественной, так как с ее помощью можно выявлять антитела к возбудителю в сыворотке крови животного, но невозможно оценить их количественное содержание.

РТГА

Одной из простейших серологических реакции является реакция торможения гемаглютинации. Она основана на том, что АТ при встрече с гомологичным АГ нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, т.к. блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс «АГ+АТ». Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия АТ сыворотки и вируса. РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр АТ к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень АГ родства двух вирусов. Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток РТГА: возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Принцип титрования АТ в РТГА состоит в следующем:

готовят ряд последовательных (обычно 2-х кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаще по 0,25 или 0,2 мл);

к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ;

смеси выдерживают определенное время при определенной температуре, ко всем смесям добавляют равные объемы 1-% суспензии отмытых эритроцитов;

после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах.