2.2.7. Регуляция ферментативных реакций

В каждой растительной клетке и во всём организме в целом одно-временно происходят многие тысячи биохимических реакций, которые осуществляются строго согласованно в соответствии с генетической про-граммой развития организма и функционированием механизмов адаптации растений к изменениям условий окружающей среды. При этом растения и другие высшие организмы представляют собой очень хорошо сбалан-сированные и эффективно действующие саморегулирующиеся системы. Это оказывается возможным благодаря тому, что в любых живых орга-низмах имеются системы регуляции биохимических процессов, связанные прежде всего с воздействием на синтез и каталитическую активность фер-ментов.

В зависимости от особенностей синтеза все ферменты подразделяют на две группы – конститутивные и индуцируемые (или индуцибельные) ферменты. Конститутивные ферменты постоянно синтезируются в клет-ках организма независимо от их состояния и условий окружающей среды. Они катализируют жизненно важные и постоянно протекающие в орга-низме биохимические реакции, например, реакции дыхания.

Однако синтез многих других ферментов почти все время подавлен специфическими белками-репрессорами. Но действие белка репрессора, ингибирующего синтез фермента, прекращается при появлении в клетке определённого вещества, превращение которого катализирует данный фер-мент, или под воздействием какого-либо другого фактора, способного по-нижать ингибиторную активность белка-репрессора, при этом иниции-руется синтез белка-фермента. Образующиеся в результате такого регу-ляторного механизма ферментные белки получили название индуцируемых ферментов.

Регуляция скорости реакций, катализируемых конститутивными ферментами, осуществляется с помощью аллостерических активаторов и ингибиторов, называемых аллостерическими эффекторами. Они способ-ны связываться с определённым участком молекулы фермента, который пространственно удалён от каталитического центра, при этом происходит изменение конформации ферментного белка, вызывающее усиление или ослабление его каталитических свойств. Участок связывания аллостери-ческого эффектора называют аллостеричеким центром фермента, а сами ферментные белки, имеющие аллостерический центр, получили название аллостерических ферментов. Связывание эффектора с аллостерическим центром фермента происходит на основе такой же специфической реакции, как и связывание субстрата с каталитическим центром ферментного белка.

Аллостерические ферменты чаще всего представляют собой олиго-мерные белки, в каждой субъединице которых имеются центры связы-вания для субстрата, активатора и ингибитора. Такой белок может нахо-диться в двух конформациях, между которыми существует подвижное рав-новесие. В одной из них он связывает молекулы активатора, которые вы-зывают перестройку пространственной структуры ферментного белка и оп-тимизацию структуры каталитического центра (рис. 2.10). В другой кон-формации субъединицы аллостерического фермента связывают молекулы ингибитора, под действием которого ферментный белок переходит в неак-тивное состояние.

Рис. 2.10. Взаимодействие аллостерического

фермента с активатором и ингибитором

1 – активатор, связанный с аллостерическим цен-тром фермента; 2 – субстрат, связанный с катали-тическим центром фермента; 3 – ингибитор, связан-ный с аллостерическим центром фермента; А и Б –

полипептидные субъединицы фермента

Общее число молекул фермента, находящихся в каталитически ак-тивной конформации, зависит от соотношения концентраций активатора, ингибитора и субстрата. При достаточно высокой концентрации ингиби-тора аллостерический фермент находится преимущественно в каталити-чески неактивной конформации и скорость ферментативной реакции очень сильно замедляется. Если в физиологической среде создаётся высокая кон-центрация активатора, то аллостерический фермент переходит в каталити-чески активную конформацию, обеспечивая ускорение катализируемой ре-акции. Роль активаторов и ингибиторов аллостерических ферментов вы-полняют биохимические метаболиты, образующиеся в ходе жизнедеятель-ности организма.

Так, например, связывание СО₂ с рибулозо-1,5-дифосфатом в ходе фотосинтеза катализирует аллостеричесий фермент рибулозодифосфаткар-боксилаза (см. раздел 3.1.1). Аллостерическим активатором этого фермен-та служит фруктозо-6-фосфат, образующийся в процессе превращения и взаимодействия продуктов данной реакции, тогда как другой продукт реакций фотосинтеза фруктозо-1,6-дифосфат действует как аллостеричес-кий ингибитор фермента рибулозодифосфаткарбоксилазы. Если в хлоро-пластах в результате действия каких-либо факторов замедляется превраще-ние фруктозо-1,6-дифосфата во фруктозо-6-фосфат, то происходит накоп-ление этого продукта и он аллостерически подавляет действие фермента рибулозодифосфаткарбоксилазы, вследствие чего скорость включения СО₂ в углеводные продукты фотосинтеза понижается.

Активность дыхательного фермента фосфофруктокиназы, катализи-рующего фосфорилирование фруктозо-6-фосфата от АТФ с образованием фруктозо-1,6-дифосфата, аллостерически активируется повышенной кон-центрацией АДФ и ингибируется повышенной концентрацией АТФ.

Аллостерической регуляции, как правило, подвержены так называе-мые ключевые ферменты, которые катализируют лимитирующие стадии биохимических превращений, в ходе которых происходит значительное уменьшение свободной энергии. Ферменты, катализирующие другие этапы в данной цепи превращений, чаще всего не обладают аллостерическими свойствами, поэтому их действие в основном определяется концентра-циями субстратов и образующихся продуктов. Почти всегда к лимити-рующим стадиям, которые катализируют аллостерические ферменты, от-носятся начальные реакции в цепях последовательных биохимических превращений и реакции, приводящие к ветвлению метаболических путей.

Наиболее распространены два вида аллостерических механизмов ре-гуляции: ингибирование по типу отрицательной обратной связи и регу-ляция опережающего типа, или активация предшественником. Ингибиро-вание по типу отрицательной обратной связи происходит в том случае, когда наблюдается накопление конечного продукта в цепи последова-тельных биохимических превращений, что может вызвать нарушение об-мена веществ. Этот метаболит действует как аллостерический ингибитор, понижая активность ферментов, катализирующих лимитирующие стадии данного метаболического пути и в первую очередь фермента, который катализирует начальный этап превращений.

В ряде других реакций осуществляется регуляция опережающего типа (активация предшественником), когда образовавшийся метаболит ал-лостерически активирует фермент, катализирующий его превращение, или другой фермент в цепи последующих превращений. Так, например, осу-ществляется аллостерическая активация продуктом первой реакции цикла Кребса лимонной кислотой фермента изоцитратдегидрогеназы, катализи-рующей один из последующих этапов её превращения.

На рисунке 2.11 показана схема возможной аллостерической регуля-ции синтеза двух биохимичеких продуктов из одного метаболического предшественника (A). Если по какой-либо причине увеличивается концен-трация продукта Р₁, то он аллостерически ингибирует фермент Ф_сд и дей-ствует как аллостерический активатор на фермент Ф_ск, переводя таким об-разом метаболические реакции на синтез продукта Р₂. Если же продукт Р₂ также будет накапливаться, то он аллостерически игибирует фермент Ф_ск, а образующийся продукт С уже действует как аллостерический ингибитор фермента Ф_АВ, катализирующего начальную стадию превращений. В цепи превращений С → Р₁ продукт Д алостерически активирует действие фер-мента Ф_EF, обеспечивая сдвиг равновесия в реакции Д D Е для образования продукта Е.

Рис. 2.11. Возможная схема аллостерической регуляции фермента-

тивных реакций синтеза двух биохимических продуктов Р₁ и Р₂

А – первичный субстрат; В, С, Д, Е, F, К, М – промежуточные продукты;

Р₁ и Р₂ – конечные продукты; Ф_АВ, Ф_СД, Ф_EF, Ф_СК – аллостерические ферменты;

1 – аллостерическое ингибирование; 2 – аллостерическая активация

На примере рассмотренной схемы аллостерической регуляции пока-зано лишь одно из звеньев довольно сложной общей системы метабо-лических взаимодействий в организме, включающей элементы множест-венной регуляции, когда один и тот же метаболит может аллостерически воздействовать на целую группу ферментов, катализирующих биохими-ческие превращения в разных метаболических путях, объединяя их в еди-ную регуляторную систему. Благодаря этому формируется довольно слож-ная и хорошо сбалансированная система регуляции всех биохимических превращений, из которых складывается в целом обмен веществ организма. В результате существования такой перекрёстной системы регуляции ока-зывается возможным переключение биохимических превращений с одного метаболического пути на другой.

При рассмотрении схем регуляции ферментативных реакций следует отметить очень важную особенность. Если фермент представлен в орга-низме набором изоферментов, то активность каждого изофермента регу-лируется разными метаболитами, что придаёт системе аллостерической ре-гуляции метаболических реакций большую лабильность и эффективность.

Быстрый перевод фермента в активную или неактивную форму может происходить также путём ковалентной модификации его молекул в результате присоединения фосфатных групп или нуклеотидных радикалов. В свою очередь, ферменты, катализирующие ковалентную модификацию, регулируются по аллостерическому механизму.

Регуляция активности индуцируемых ферментов осуществляется как в процессе их синтеза, так и с участием аллостерических механизмов. Син-тез ферментов, как и других белков, представляет собой довольно слож-ный биохимический процесс, который включает синтез рибосомной (рРНК), транспортной (тРНК) и матричной (мРНК) рибонуклеиновых кислот, называемый транскрипцией.

С участием рибосомной РНК происходит образование рибосом, ко-торые при взаимодействии с матричной и транспортной РНК осуществ-ляют синтез ферментных и других белков. Этот процесс называют тран-сляцией. Установлено, что у высших организмов регуляция синтеза фер-ментов может происходить в процессе как транскрипции, так и трансля-ции. Однако значительно лучше изучен механизм регуляции синтеза фер-м ентов на уровне транскрипции. Принципиальная схема такого процесса представлена на рисунке 2.12.

Рис. 2.12. Схема регуляции синтеза фермента белком-репрессором

1 – белок-репрессор присоединён к одному из участков промотора; 2 – белок-ре-прессор переведён в неактивное состояние аллостерическим эффектором; 3 – фер-мент РНК-полимераза, который присоединяется к промотору после перевода в не-активное состояние белка-репрессора; Э – аллостерический эффектор, активируе-

мый субстратом синтезируемого фермента

Основной регулируемый этап на этой схеме – синтез матричной РНК, катализируемый ферментом РНК-полимеразой. Этот фермент в ре-зультате специфического взаимодействия связывается с определённым участком молекулы ДНК – промотором, после чего он способен катализи-ровать синтез мРНК. Однако действие РНК-полимеразы блокирует белок-репрессор, который связывается с промотором в акцепторной зоне, выклю-чая таким образом процесс транскрипции (т. е. синтез мРНК).

Белок-репрессор относится к аллостерическим белкам. Аллостери-ческими эффекторами, воздействующими на белки-репрессоры в системе синтеза ферментов, являются или сами субстраты, которые должны прев-ращаться с участием синтезируемых ферментов, или вещества, активиру-емые субстратами. И в том и в другом случае при поступлении в клетки организма соответствующих субстратов происходит аллостерическая пере-стройка структуры белка-репрессора, вследствие чего уменьшается срод-ство этого белка к акцепторной зоне промотора и он уже не препятствует действию фермента РНК-полимеразы, катализирующей синтез мРНК. Да-лее уже с участием мРНК синтезируются молекулы ферментного белка, ко-торый необходим для превращения поступившего субстрата. После того как произойдет полное превращение субстрата, его воздействие на белок-репрессор прекращается, вследствие чего восстанавливается сродство это-го белка к промотору и синтез мРНК снова блокируется.

Регуляция синтеза ферментов очень хорошо изучена у бактерий. У растений также известны индуцируемые ферменты, к ним относятся a-амилазы семян, нитратредуктаза и многие другие ферменты азотного об-мена, некоторые протеолитические ферменты.

В ходе жизнедеятельности организмов синтез некоторых ферментов может ингибироваться конечными продуктами биохимических превраще-ний по механизму отрицательной обратной связи. В этом случае накапли-вающийся конечный продукт, взаимодействуя с аллостерическим центром белка-репрессора, усиливает его сродство к ДНК, в результате чего белок- репрессор связывается с промотором в акцепторной зоне и останавливает транскрипцию генов, кодирующих структуру полипептидов данного фер-ментного белка. Вследствие понижения концентрации фермента умень-шаются скорость катализируемой им биохимической реакции и выход об-разующихся продуктов, что, в свою очередь, окажет соответствующие вли-яние на всю цепочку последовательных биохимических превращений со-гласно принципам смещения равновесия в химических реакциях и, как следствие, понизит концентрацию конечного продукта.

В качестве примера регуляции синтеза ферментов по механизму от-рицательной обратной связи можно рассмотреть схему реакций образо-вания аминокислот лизина, треонина, метионина и изолейцина у растений и ряда микроорганизмов (рис. 2.13). Исходным соединением для синтеза указанных аминокислот служит аспарагиновая кислота. В схеме представ-ленных биохимических реакций выделены две лимитирующие стадии, наиболее сильно влияющие на суммарную скорость процесса. Одна из них – первая реакция в цепи превращений аспарагиновой кислоты в указанные на схеме аминокислоты, её катализирует фермент аспартаткиназа. Вторая находится на одном из разветвлений в указанной цепи превращений, и она даёт начало реакциям, в ходе которых из полуальдегида аспарагиновой кислоты синтезируются аминокислоты метионин, треонин и изолейцин.

Рис. 2.13. Схема регуляции синтеза ферментов конечными продукта-ми, образующимися в ходе последовательных превращений аспараги-

новой кислоты

Эту стадию катализирует фермент гомосериндегидрогеназа. Как по-казано на схеме, синтез этих двух ферментов зависит от концентрации ко-нечных продуктов – лизина, метионина, треонина и изолейцина. При этом следует отметить, что указанные аминокислоты не только осуществляют ингибирование синтеза ферментов аспартаткиназы и гомосериндегидро-гиназы, но и подавляют их активность по аллостерическому механизму.

Эффективность регуляции ферментативных реакций путём воздей-ствия на синтез ферментов в значительной степени определяется периодом полужизни ферментов. Чем дольше сохраняется активность фермента пос-ле прекращения его синтеза, тем менее эффективна регуляция фермента-тивной реакции и потребуется достаточно много времени, чтобы пол-ностью её остановить (несколько часов или даже дней). В свою очередь, период полужизни фермента зависит от скорости его инактивации в клетке и гидролитического расщепления протеолитическими ферментами.

Таким образом, синтез и деградация ферментов находятся в дина-мическом равновесии, и регуляция активности ферментов на этом уровне происходит сравнительно медленно. Более быстро она осуществляется с участием аллостерических ферментов и посредством механизма ковалент-ной модификации ферментных белков. В этом случае регуляторное воздей-ствие направлено непосредственно на ферменты.

Некоторые ферменты синтезируются в виде проферментов (зимоге-нов), представляющих собой каталитически неактивные белки, которые могут переходить в активную форму в результате отщепления от их мо-лекул определённых полипептидов, восстановления дисульфидных груп-пировок (−S−S−) в тиоловые группы (−SH), ковалентной модификации мо-лекулы путём фосфорилирования и т. д. Синтезированные на рибосомах эндоплазматического ретикулума проферменты очень часто упаковыва-ются в зимогенные гранулы, которые могут перемещаться к поверхности клетки или даже секретироваться в окружающую среду. В виде зимоген-ных форм синтезируются многие пищеварительные ферменты человека и животных (пепсин, трипсин, химотрипсин, карбоксипептидазы), расти-тельный фермент папаин, некоторые гидролитические ферменты семян растений (амилазы и протеазы).

Важными компонентами регуляторной системы растений являются фитогормоны. Поскольку они легко переносятся по флоэме, эти физиоло-гически активные соединения могут выполнять функцию переноса регуля-торных сигналов от одних тканей или органов растения к другим, вызывая синтез и активацию определённых ферментов.

Действие гормонов на активацию биохимических процессов может осуществляться двумя путями. Первый путь – это быстрое регуляторное воздействие, связанное с активацией ферментов путём ковалентной моди-фикации. В этом случае гормон соединяется с определённым белком в составе клеточной мембраны, который называют рецепторным белком. Под действием гормона происходит конформационное изменение рецеп-торного белка в составе мембраны, которое инициирует перестройку всей мембранной структуры, вызывая активацию связанных с мембраной ферментов. В свою очередь, с участием этих ферментов приводится в дей-ствие рассмотренный выше механизм ковалентной модификации фермент-ных белков, катализирующих различные метаболические реакции в клетке.

Второй путь связан с воздействием гормонов на регуляторную сис-тему синтеза ферментных белков. На основе специфической реакции гор-мон соединяется с цитоплазматическим белком-рецептором. Затем образо-вавшийся гормон-рецепторный комплекс перемещается в ядро и взаимо-действует там с регуляторным белком, инициируя или замедляя процесс транскрипции соответствующего гена. В опытах по изучению действия фиторегуляторов выяснено, что ауксины активируют в цитоплазме синтез кислых гидролаз (проявляющих активность в кислой среде), цитокинины – фермента нитратредуктазы, гиббереллины – образование в прорастающих зерновках злаков a-амилаз, катализирующих гидролитическое расщепле-ние молекул крахмала.

Регуляция светом. В растениях многие биохимические процессы регулируются светом, который воспринимают в качестве регуляторного сигнала рецепторные белки – фитохром и флавопротеиды.

При поглощении красного света (660 нм) в структуре молекулы фитохрома происходит конформационная перестройка, которая переводит этот белок в активированное состояние. он связывается с клеточной мем-браной и вызывает регуляторное действие примерно по такому же меха-низму, как и гормоны. Если же активная форма фитохрома поглощает свет с длиной волны 730 нм, этот белок превращается в неактивную форму. В опытах установлено, что фитохром регулирует активность ферментов, катализирующих реакции фотосинтеза (фруктозо-1,6-дифосфатаза, глице-ральдегидфосфатдегидрогеназа), проницаемость клеточных мембран в листьях, синтез гормонов.

Другая группа фотосенсорных белков представлена флавопротеи-дами. У них хромофором служит флавиновая группировка, способная под-вергаться фотохимическому превращению под воздействием синего света.