2.2.2. Строение двухкомпонентных ферментов

Структурной основой двухкомпонентного фермента, как и одноком-понентного, является молекула белка, которую в данном случае называют апоферментом, а небелковую часть фермента принято называть кофер-ментом. Коферменты образуются из витаминов, нуклеотидов и других ак-тивных группировок, включающих атомы металлов, серы, а также произ-водные различных органических соединений (гетероциклические радика-лы пиррола и имидазола, хиноны, липоевая кислота, кетокислоты и др.).

Коферменты имеют разные формы соединения с белковой частью фермента. Одни из них довольно легко отделяются от ферментного белка и могут самостоятельно участвовать в биохимических реакциях, другие свя-заны с белковой частью фермента очень прочно и не могут быть выделены без разрушения молекулы фермента. Коферменты, прочно связанные с ферментным белком, называют простетическими группами. К наиболее хорошо изученным простетическим группам относятся биотин, липоевая кислота, флавиновые коферменты и железосодержащие коферменты – гемы.

Витамин биотин выполняет роль простетической группы в составе молекул ферментов карбоксилаз, катализирующих реакции образования карбоксильных групп с участием СО₂ (–НСО₃⁻), и карбоксилтрансфераз, участвующих в переносе карбоксильных групп. В составе этих ферментов молекула биотина своей карбоксильной группой соединяется с ε-амино-группой остатка аминокислоты лизина, находящегося в структуре белко-вой части фермента.

В ходе реакций карбоксилирования и транскарбоксилирования био-тин, связанный с белком фермента, вначале превращается в карбоксибио-тин, а затем передаёт карбоксильную группу на субстрат. При этом уста-новлено, что образование карбоксильной группы с участием СО₂ (–НСО₃⁻) сопряжено с гидролизом АТФ и эту реакцию также катализирует биотин-зависимый фермент. В качестве примера рассмотрим действие фермента пируваткарбоксилазы, катализирующего превращение пировиноградной кислоты в щавелевоуксусную:

биотин карбоксибиотин

(в составе фермента)

карбоксибиотин пировиноградная биотин щавелевоуксусная

(в составе кислота (в составе кислота

фермента) фермента)

В составе фермента содержатся белковые субъединицы, участвую-щие в связывании бикарбонат-иона, АТФ и пирувата, а также катализиру-ющие присоединение карбоксильной группы от бикарбоната к биотину с образованием карбоксибиотина и далее перенос карбоксильной группы от карбоксибиотина на молекулу пировиноградной кислоты, а биотиновый кофермент регенерируется снова в биотин.

Липоевая кислота в качестве простетической группы входит в сос-тав ферментов, катализирующих окислительное декарбоксилирование a-кетокислот. Как и биотин, она соединяется амидной связью с ε-амино-группой аминокислоты лизина, входящего в состав ферментного белка:

остаток липоевой кислоты остаток лизина в белке

В процессе реакции липоевая кислота подвергается восстановлению и становится акцептором ацильного радикала кетокислоты, после чего ацильный радикал связывается с другим коферментом, а липоевая кислота снова превращается в окисленную форму. Наиболее хорошо изучено действие ферментов, имеющих в качестве кофермента липоевую кислоту, при окислительном декарбоксилировании пировиноградной и α-кетоглу-таровой кислот (см. раздел 3.1.2).

Флавиновые простетические группы представлены двумя видами соединений – флавинадениндинуклеотидом (ФАД) и флавинмононуклео-тидом (ФМН), которые ковалентно связаны с ферментными белками.

Коферментная группировка ФМН представляет собой витамин рибо-флавин, фосфорилированный по спиртовой группе пятого углеродного атома рибита, а в составе ФАД к ФМН путём взаимодействия фосфатных остатков присоединяется нуклеотидный радикал аденозинмонофосфата (АМФ). Чаще всего флавиновая простетическая группа соединяется с фер-ментным белком в результате образования ковалентной связи (показана стрелкой) между углеродом метильной группы, соединённой с восьмым углеродным атомом диметилизоаллоксазина, и азотом гетероцикличес-кого радикала гистидина или атомом серы цистеинового остатка в составе белка.

флавинмононуклеотид (ФМН)

Флавинадениндинуклеотид (ФАД)

Каталитическая активность указанных простетических групп прояв-ляется в том, что они способны присоединять атомы водорода к атомам азота диметилизоаллоксазина в положениях 1 и 5 с последующей пере-группировкой двойных связей:

В результате присоединения атомов водорода флавиновый кофер-мент превращается в восстановленную форму, которая сокращённо запи-сывается ФАД · Н₂ или ФМН · Н₂, а окисленная форма соответственно ФАД и ФМН.

В настоящее время известны несколько десятков ферментов, имею-щих флавиновые коферменты. Они могут функционировать в качестве переносчиков водорода в дыхательных реакциях и катализируют многие реакции окисления: спиртов в альдегиды, дигидролипоевой кислоты в липоевую, гликолевой кислоты в глиоксиловую. С участием флавиновых ферментов происходит образование α,β-ненасыщенных производных жир-ных кислот и превращение янтарной кислоты в фумаровую.

Важные функции в организмах выполняют ферменты, имеющие в своём составе простетические группы в виде гема. Гемы представляют со-бой устойчивые хелатные комплексы порфириновой группировки с ато-мом железа. Порфириновая группировка образуется из четырех гетеро-циклических структур пиррола (обозначаемых А, В, С, D), соединенных метеновыми радикалами (=СН–) в более крупную циклическую группи-ровку, к которой присоединены ещё восемь боковых радикалов. В зависи-мости от строения этих радикалов различают разные типы гемов (прото-гем, гем а, гем c и др.). При соединении со специфическим белком гем может выполнять роль переносчика электронов, катализировать окисли-тельно-восстановительные реакции с участием кислорода или пероксида водорода.

протогем

Гемопротеиды, участвующие в переносе электронов, получили наз-вание цитохромов. Все они представляют собой сравнительно низкомо-лекулярные белки, имеющие в качестве простетической группы гем, прочно связанный с молекулой белка. Цитохромы, различающиеся строе-нием гема и белковой молекулы, обычно обозначают латинскими буквами а, в, с, d, f.

Активным компонентом в структуре гема, принимающим участие в переносе электронов, является атом железа. В окисленном цитохроме железо содержится в виде Fe³⁺, а после присоединения электрона оно превращается в восстановленную форму Fe²⁺ :

цит (Fe³⁺) + `е ® цит ( Fe²⁺).

Восстановленный цитохром передает электрон другому акцептору, превращаясь в окисленную форму, способную снова присоединять элек-трон от донора:

цит (Fe²⁺) + акцептор ® цит (Fe³⁺) + восстановленный акцептор.

Ферменты пероксидаза и каталаза содержат простетическую группу в виде протогема, включающего железо в виде Fe³⁺. Пероксидазы катали-зируют окислительно-восстановительные реакции с участием пероксида водорода (Н₂О₂) по схеме:

пероксидаза

Н₂О₂ + АН₂ ¾¾¾¾® 2Н₂О + А

Много этих ферментов синтезируется в растительных тканях, осо-бенно в пероксисомах.

Каталаза катализирует разложение пероксида водорода на воду и кислород:

каталаза

2Н₂О₂ ¾¾® 2Н₂О + О₂

Пероксид водорода оказывает повреждающее воздействие на клеточ-ные мембраны, подвергая их пероксидному окислению, а фермент каталаза предотвращает накопление Н₂О₂ в клетках организма.

Активную роль в переносе электронов играют железосерные белки, у которых простетическая группа образуется атомами железа, соединён-ными лабильными связями с атомами серы. Атомы Fe соединяются с белком через атомы серы четырёх остатков цистеина. Очень часто атомы железа при соединении с атомами серы образуют Fe₄S₄-кластеры (рис. 2.4).

Рис. 2.4. Пространственное изображение Fe₄S₄–кластера

в составе железосерного белка

Fe – атомы железа; S – атомы лабильной серы; Б – полипептидные цепи белка,

соединённые с атомами Fe через тиоловые группировки цистеиновых остатков

Полипептидная цепь ферментного белка закручена вокруг железо-серной простетической группы, включающей по 4 атома железа и серы, а также боковые цепи четырёх остатков цистеина, связанных через атомы серы с железом. Каждый из атомов серы в Fe₄S₄-кластере связан с тремя атомами железа. Простетическая группа железосерного белка способна присоединять и передавать другому акцептору один электрон. При этом электроны, акцептируемые Fe₄S₄-кластером, не присоединяются к какому-либо конкретному атому, а взаимодействуют с атомами и Fe, и серы.

К железосерным белкам относятся ферредоксины бактерий и расте-ний, осуществляющие одноэлектронный перенос. Их простетические груп-пы могут содержать по 2 или 4 атома железа и такое же число атомов серы. Так, например, в ферредоксине растительных хлоропластов содержится железосерный кластер, включающий два атома железа и два атома лабиль-ной серы. С белковой частью атомы железа соединены через атомы серы цистеиновых остатков. Строение простетической группы хлоропластного ферредоксина можно представить в виде следующей схемы:

К числу коферментов, которые связаны с белковой частью фермента лабильными связями, относятся никотинамидадениндинуклеотид (НАД), никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ), кофермент А (КоА), а также коферментные формы витаминов В₁, В₆, В₁₂, фолиевой кислоты. Эти коферменты удерживаются в активном центре ферментов водородными связями и силами электростатического взаимодействия заряженных групп-пировок кофермента и функциональных групп аминокислотных остатков, образующих активный центр фермента. В связи с этим указанные кофер-менты легко отделяются от белковой части фермента.

Молекулы кофермента НАД образуются из витамина РР (амид нико-тиновой кислоты) и нуклеотида АМФ (аденозинмонофосфат), соединён-ных через остатки ортофосфорной кислоты и по химическому строению представляют собой динуклеотиды. НАДФ отличается от НАД только на-личием дополнительной фосфатной группировки, присоединённой ко вто-рому атому углерода рибозы в составе АМФ.

Ферменты, имеющие в своём составе НАД и НАДФ, катализируют реакции отщепления водорода от восстановленных субстратов и перенос их на соответствующий акцептор. Очень часто таким акцептором служит окисленный флавиновый кофермент.

окисленная форма никотинамидадениндинуклеотида (НАД⁺)

окисленная форма никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ⁺)

Активной группировкой, участвующей в отщеплении и переносе водорода, служит окисленная форма никотинамида. От субстрата отщепля-ются два атома водорода в виде двух электронов и двух протонов, при

этом один электрон и протон взаимодействуют с четвёртым углеродным атомом, а второй электрон с атомом азота никотинамида в составе фер-мента, переводя его в восстановленную форму, тогда как второй протон не связывается с коферментом и в дальнейшем непосредственно переходит на акцептор, с которым взаимодействует восстановленный кофермент. Окис-ленную форму НАД принято сокращённо записывать в виде НАД⁺, а вос-становленную – НАД × Н. Соответственно окисленная форма НАДФ записывается НАДФ⁺, восстановленная – НАДФ × Н.

окисленная форма восстановленная форма

НАД(Ф) НАД(Ф)

Поскольку в реакциях, катализируемых НАД- и НАДФ-содержа-щими ферментами, происходит отщепление водорода от субстратов, такие ферменты называют дегидрогеназами. Схематически действие дегидроге-назы, имеющей кофермент НАД, можно представить следующим образом:

Субстрат−Н₂ + НАД⁺–фермент ¾® Субстрат_окисл. + Фермент–НАД × Н + Н⁺

Фермент–НАД × Н + Н⁺ + Акцептор ¾® НАД⁺–фермент + Акцептор–Н₂

НАД и НАДФ очень легко отделяются от ферментного белка и могут существовать в свободной форме, диффундируя от одного фермента к дру-гому. Свободные формы этих коферментов могут также переноситься по флоэмной системе растений от донорных клеток и органов к акцепторным.

НАД-зависимые ферменты наиболее активны в ускорении реакций, связанных с отщеплением водорода от субстратов, а ферменты, имеющие восстановленные коферменты НАДФ, чаще всего используются как силь-ные восстановители.

Ферменты, катализирующие перенос ацильных групп (R–C–), имеют ||

О

в каталитическом центре активную группировку, называемую кофермен-том А (КоА), которая связана с апоферментом лабильными (нековалент-ными) связями и поэтому может легко отделяться от фермента.

В составе кофермента А содержится остаток b-меркаптоэтиламина с реакционно-способной HS–группой, соединённой амидной связью с кар-боксильной группой пантотеновой кислоты, которая фосфорилирована по концевой гидроксильной группе. Через остаток ортофосфорной кислоты указанная группировка соединяется с неклеотидной частью, представлен-ной аденозинмонофосфатом (АМФ), у которого гидроксил при третьем углеродном атоме рибозы этирифицирован дополнительным фосфатным остатком.

Соединение кофермента А с белковой молекулой происходит путём образования водородных связей и возникающих электростатических взаи-модействий между аминокислотными радикалами белка в активном центре фермента и группировками нуклеотидной части и пантотеновой кислоты кофермента.

В ходе ферментативной реакции кофермент А взаимодействует с субстратом за счёт HS–группы b-меркаптоэтиламина, находящейся на конце довольно длинной гибкой цепи, которая хорошо приспособлена к созданию структурного соответствия между активным центром фермента и субстратом. В уравнениях реакций принято использовать сокращённое обозначение кофермента А – HS–КоА. Образование ацильных производ-ных кофермента А сопряжено с гидролизом АТФ:

R–COOH + HS–KoA + АТФ ¾® R–C~S–KoA + AMФ + H₄P₂O₇

||

O

При этом между углеродом карбонильной группы карбоновой кис-лоты и атомом серы кофермента возникает макроэргическая тиоэфирная связь. Активированный таким образом ацильный радикал может далее переноситься к центрам синтеза или b-окисления жирных кислот, где он уже соединяется с новым апоферментом и подвергается дальнейшим прев-ращениям.

В форме ацетилкофермента А (СН₃−С~S–КоА) этот кофермент ||

О

включается в реакции цикла ди- и трикарбоновых кислот, а также глиок-силатного цикла и участвует в целом ряде других превращений.

Коферментной формой витамина В₁ является фосфорилированное производное тиамина – тиаминпирофосфат, которое пиримидиновым кольцом соединяется с белковой частью фермента, а тиазоловой группи-ровкой взаимодействует с субстатами – a-кетокислотами или a-кетоспир-тами (см. с. 130). В ходе ферментативной реакции осуществляется a-рас-щепление указанных субстратов, в результате чего происходит декарбок-силирование a-кетокислот или альдольное расщепление a-кетоспиртов.

В составе многих ферментов, катализирующих превращения амино-кислот и аминов, в качестве кофермента используется производное вита-мина В₆ пиридоксальфосфат. Этот кофермент может оказывать каталити-ческое действие как в составе фермента, так и в свободном виде. Однако под воздействием белка, образующего фермент, значительно возрастает скорость реакции и специфичность действия катализатора. Активной частью кофермента является альдегидная группа, которая обратимо реаги-рует с аминокислотами (см. раздел 3.3.1).