Vmax – максимальная скорость ферментативной реакции при данном

количестве фермента; К_m – константа Михаэлиса фермента

Зависимость скорости ферментативной реакции (V) от концентрации субстрата может быть выражена уравнением:

[S]

V = V_max ×¾¾¾¾,

K_m + [S]

где V_max – максимальная скорость реакции при высокой концентрации субстрата, когда в каждый момент времени все молекулы фермента находятся в соединении с субстра-том (насыщение фермента субстратом); [S] – концентрация субстрата; К_m – константа Михаэлиса, названная именем Л. Михаэлиса, который внёс большой вклад в разработку теории ферментативной кинетики.

Константа Михаэлиса выражает сродство фермента к субстрату и служит важной характеристикой ферментного белка. Чем меньше констан-та Михаэлиса, тем выше молярная активность фермента и тем интенсивнее происходит ферментативный катализ. Из приведенного выше уравнения можно определить значение константы Михаэлиса:

V_max V_max

K_m = [S] ( ¾¾ – 1); при V = ¾¾ K_m = [S].

V 2

Следовательно, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции, катализируемой ферментом, до-стигает половины максимальной.

Для определения константы Михаэлиса экспериментальным путём с использованием чистого фермента находят скорость катализируемой реак-ции, включая максимальную, при разных значениях концентрации суб-страта. Затем изменение скорости ферментативной реакции в зависимости от концентрации субстрата выражают в виде графика, как показано на ри-сунке 2.8. Если на этом графике отметить скорость, равную половине максимальной, и опустить из этой точки перпендикуляр на ось абсцисс, то он укажет концентрацию субстрата, численно равную константе Михаэ-лиса.

Активаторы ферментов. Для поддержания молекулы фермента в активном состоянии необходимо наличие в среде определённых химичес-ких веществ или ионов, называемых активаторами ферментов. Роль ак-тиваторов заключается в том, что они способны переводить в активное со-стояние определённые группировки в каталитическом центре молекулы фермента и таким образом участвовать в каталитическом действии фер-ментного белка. Так, протеолитические ферменты, катализирующие гидро-литическое расщепление белков, активируются HCN, H₂S, а также вещест-вами, содержащими сульфгидрильные группы (восстановленный глютати-он, цистеин).

Многие активаторы выполняют роль дополнительного субстрата, который, взаимодействуя с истинным субстратом, переводит его в актив-ное состояние и таким образом ускоряет образование фермент-субстрат-ного комплекса. Примером такого взаимодействия могут служить фермен-тативные реакции с участием АТФ и ионов магния, в которых основной субстрат АТФ переводится в активное состояние путём образования ком-плекса с катионом магния (Мg АТФ^2–).

На каталитическую активность ферментов оказывает влияние ион-ный состав среды, способствующий формированию молекулами фермента и субстрата специфической пространственной структуры, которая позво-ляет этим молекулам активно взаимодействовать, в результате увеличи-вается скорость образования фермент-субстратного комплекса и происхо-дит ускорение ферментативной реакции в целом.

Многие ферменты активируются в присутствии ионов металлов. Из-вестны также ферменты, активность которых повышается в присутствии неорганических анионов: Cl‾, Br‾, I‾, H₂PO₄‾, НСО₃‾ и др. Так, активато-рами амилаз, катализирующих гидролиз крахмала, служат анионы галогенов.

При изучении влияния активаторов на активность ферментов было выяснено, что максимальная каталитическая активность ферментных моле-кул наблюдается при определённой концентрации активатора, при её уменьшении или увеличении по сравнению с оптимальным уровнем ката-литические свойства фермента ослабляются. Таким образом, для проявле-ния максимальной активности ферментов необходимо наличие в физиологической среде, в которой функционирует фермент, определён-ного набора специфических активаторов, содержащихся в оптимальной концентрации.

Ингибиторы ферментов. Это – вещества, которые подавляют дей-ствие ферментов. Под влиянием ингибитора скорость ферментативной ре-акции замедляется или ферментативное превращение полностью прекра-щается. Процесс воздействия ингибиторов на ферментные белки называют ингибированием ферментов. Различают обратимое и необратимое ингиби-рование и соответственно ингибиторы обратимого и необратимого дей-ствия.

При обратимом ингибировании не происходит безвозвратной потери каталитической активности фермента, так как ингибитор не разрушает пространственной структуры ферментного белка и после отделения инги-битора от фермента активность последнего восстанавливается. Различают два вида ингибиторов, вызывающих обратимое ингибирование ферментов: конкурентные и неконкурентные ингибиторы.

Конкурентные ингибиторы – вещества структурно родственные суб-страту, вследствие чего они, как и молекулы субстрата, способны связы-ваться с одним из участков в активном центре фермента, но при этом не могут подвергаться превращению под действием фермента. Молекулы фермента, связанные с ингибитором, не могут катализировать превраще-ние субстрата, поэтому скорость ферментативной реакции замедляется. Чем выше концентрация ингибитора, тем больше молекул фермента в каж-дый момент времени связаны с ингибитором и тем сильнее ингибирование.

Поскольку субстрат и ингибитор – структурные аналоги, в ходе реак-ции между ними происходит конкуренция за связывание с активным цент-ром фермента, поэтому степень игибирования ферментативного превраще-ния зависит от соотношения концентраций субстрата и ингибитора. Если концентрация субстрата во много раз превышает концентрацию ингибито-ра, то в каждый момент лишь небольшое число молекул фермента связано с ингибитором и действие ингибитора почти не проявляется.

Следует отметить, что конкурентные ингибиторы не являются пол-ными структурными аналогами субстрата, так как для связывания с фер-ментным белком ингибитору вполне достаточно, если он будет структурно совместим хотя бы с одним из участков связывания субстрата в активном центре фермента, а другая часть молекулы ингибитора может существенно отличаться от молекулы субстрата.

Хорошо изученный пример конкурентного ингибирования – дей-ствие малоновой кислоты на фермент сукцинатдегидрогеназу, катализи-рующий отщепление водорода от янтарной кислоты в цикле ди- и три-карбоновых кислот:

СООН

СН₂СООН сукцинатдегидрогеназа СНСООН |

½ ¾¾¾¾¾¾¾¾¾® || СН₂

СН₂СООН СНСООН |

СООН

янтарная кислота фумаровая кислота малоновая кислота

Малоновая кислота – структурный аналог субстрата – янтарной кис-лоты, поэтому способна связываться вместо субстрата с активным центром сукцинатдегидрогеназы, но подвергаться окислению с образованием фума-ровой кислоты малоновая кислота не может, вследствие чего молекулы фермента, связанные с малоновой кислотой, не участвуют в каталити-ческом действии и скорость превращения янтарной кислоты в фумаровую понижается. Однако если в реакционную среду добавить большое количес-тво субстрата, т. е. янтарной кислоты, то ингибирование фермента прекра-щается.

На основе конкурентного ингибирования производится подбор и синтез многих лекарственных препаратов, действие которых направлено на подавление активности ферментов инфекционной микрофлоры. Исполь-зование химических препаратов в качестве ингибиторов ферментных сис-тем возбудителей различных заболеваний получило название химиоте-рапии. Для химиотерапии подбирают такие конкурентные ингибиторы, которые по структуре наиболее полно соответствуют участкам связывания субстрата в активном центре ферментов и поэтому обладают очень силь-ным ингибиторным действием.

Неконкурентные ингибиторы не имеют структурной аналогии с суб-стратами и поэтому взаимодействуют не с участком связывания субстрата в активном центре фермента, а с другим участком ферментной молекулы, вызывая инактивацию каталитического центра. При этом ингибитор не вступает в конкурентное взаимодействие с субстратом и не препятствует связыванию субстрата в активном центре фермента, однако молекула суб-страта не подвергается превращению, так как под влиянием ингибитора становятся неактивными группировки фермента, которые активируют суб-страт. Поскольку при неконкурентном ингибировании субстрат и ингиби-тор связываются с разными участками молекулы фермента, действие та-кого ингибитора не ослабляется при увеличении концентрации субстрата в физиологической среде.

К ингибиторам неконкурентного действия относятся цианиды, кото-рые подавляют активность ферментов, содержащих атомы Fe или Cu (ци-тохромоксидазы, фенолоксидазы и др.). Ингибитор, содержащий цианид-ные группировки (CN‾), образует комплексное соединение с металлом, входящим в состав фермента, в результате чего атом металла теряет спо-собность участвовать в каталитическом действии фермента и скорость ферментативной реакции понижается; в состоянии же насыщения фермен-та ингибитором она практически полностью прекращается. При удалении цианида из реакционной среды каталитическая активность фермента вос-станавливается.

Неконкурентное ингибирование могут вызывать также катионы во-дорода, которые вследствие малых размеров не препятствуют связыванию субстрата, но при соединении с активными группировками в каталити-ческом центре фермента изменяют их электрический заряд и переводят эти группировки в неактивное состояние, в результате чего происходит инак-тивация ферментных молекул.

В процессе необратимого ингибирования молекула ингибитора обра-зует ковалентную связь с одной из группировок в активном центре фер-мента, в результате чего становится невозможным его каталитическое дей-ствие. Поскольку образовавшееся соединение ингибитора с ферментом не разрушается и не диссоциирует в условиях физиологической среды, в ко-торой функционирует фермент, каталитическая активность фермента по-давляется необратимо.

Многие ингибиторы, вызывающие необратимое ингибирование, об-ладают строго избирательным действием, так как способны взаимодей-ствовать только с определёнными группировками в активном центре ферментов. Так, многие галогенопроизводные органических веществ явля-ются специфическими ингибиторами ферментов, содержащих в активном центре сульфгидрильные группы (SН-группы). Взаимодействие таких ин-гибиторов с молекулой фермента происходит по следующей схеме:

Фермент–SH + X–R ¾® фермент–S–R + HX,

где Х – атомы галогенов (Cl, I, Br, F).

Фосфорорганические соединения необратимо ингибируют фермен-ты, имеющие в активном центре гидроксильные группы остатков амино-кислоты серина. Взаимодействие с ферментом одного из таких ингиби-торов диизопропилфторфосфата можно представить в виде следующей реакции:

В результате присоединения к молекулам фермента фосфороргани-ческого радикала происходит очень сильное подавление его каталити-ческой активности.

Фосфорорганические ингибиторы – сильные яды, необратимо инги-бирующие ферменты, которые катализируют гидролиз сложных эфиров холина (холинэстеразы), а также белков (сериновые протеиназы). Один из ферментов, чувствительных к указанным ингибиторам, – ацетилхолин-эстераза, которая катализирует гидролиз ацетилхолина, образующегося в клетках нервных тканей при передаче нервных импульсов. В результате подавления фосфорорганическим ингибитором активности ацетилхолин-эстеразы прекращается гидролиз ацетилхолина и он накапливается в нерв-ных клетках. Это нарушает передачу нервных импульсов, что вызывает па-ралич и смерть организма. Такие ингибиторы используют в сельском хо-зяйстве в качестве инсектицидов нервнопаралитического действия.

Все ферменты необратимо ингибируются катионами тяжёлых ме-таллов (Hg²⁺, Pb²⁺, Ag⁺, Cu²⁺ и др.), а также галогенопроизводными уксус-ной кислоты (трихлоруксусная, йодуксусная кислоты и др.), которые при соединении с SH-группами ферментного белка образуют нерастворимые соединения. Следует отметить, что все факторы, вызывающие денатура-цию белков, неспецифически подавляют действие любого фермента, так как основу его составляет молекула белка.

В семенах, клубнях, листьях и других органах растений выявлены специфические белки с молекулярными массами от 5 до 60 тыс., которые образуют с ферментами неактивные комплексы, в результате чего проис-ходит ингибирование ферментативных реакций. Такие белки называют белковыми ингибиторами ферментов. В зависимости от особенностей вза-имодействия с ферментами различают белковые ингибиторы эндогенного и экзогенного действия.

Белковые ингибиторы эндогенные действия образуют неактивные комплексы с ферментами собственного организма и таким образом учас-твуют в регулировании определённых биохимических процессов в органах и тканях растений. Так, в процессе созревания зерновок злаковых растений в них усиливается синтез белковых ингибиторов амилаз и протеаз, ката-лизирующих соответственно гидролиз крахмала и запасных белков, вслед-ствие чего к концу созревания зерновок большая часть указанных фер-ментов связывается с белками-ингибиторами. Благодаря такому действию ингибиторов в зерне происходит накопление крахмала и запасных белков.

Белковые ингибиторы экзогенного действия подавляют каталити-ческую активность ферментов чужеродного организма. обнаружено, что некоторые растительные белки образуют неактивные комплексы с пище-варительными ферментами насекомых, животных, птиц, человека, вызывая у них нарушения в перевариваривании пищи. К таким ингибиторам отно-сятся некоторые альбумины, содержащиеся в зерновках злаковых и семе-нах бобовых растений. Они специфически подавляют активность a-ами-лаз, пепсина, трипсина и химотрипсина, а белок зерна пшеницы пуро-тионин обладает бактерицидным и фунгицидным действием.