2.2.1. Механизм действия ферментов
Как и любые катализаторы, ферментные белки участвуют в биохи-мических реакциях, но не входят в состав образующихся продуктов. В ходе реакций они ускоряют взаимодействие реагирующих веществ. В об-ратимом превращении фермент ускоряет как прямую, так и обратную реакцию, не смещая химического равновесия.
В соответствии с принципами термодинамики в химическое взаимо-действие вступают молекулы вещества, которые обладают достаточным запасом энергии. Такие молекулы принято называть активными, или активированными. Если большая часть молекул реагирующего вещества находится в активном состоянии, то химическая реакция происходит очень быстро. Для активирования молекул требуется определённая затрата энергии. Количество энергии, необходимое для перевода всех молекул 1 моля вещества в активированное состояние, принято называть свободной энергией активации.
Одно и то же химическое вещество в каждой конкретной реакции имеет совершенно определённую энергию активации. Чем выше энергия активации, тем труднее вещество вступает в химическую реакцию, поэ-тому скорость её будет очень низкой. В таких условиях для ускорения химического превращения реагирующих веществ в продукты реакции применяют катализаторы.
В биохимических превращениях роль катализаторов выполняют фер-ментные белки. С участием фермента биохимическая реакция направ-ляется обходным путём, через промежуточные стадии, для осуществления которых требуется значительно меньшая энергия активации, вследствие чего такие превращения проходят с очень высокой скоростью (рис. 2.2). Ферменты снижают энергию активации реагирующих веществ значи-тельно сильнее, чем обычные химические катализаторы
Рис. 2.2. Энергия активации (DGа) вещества А в некатализируемой
реакции (А+Б ® АБ) и при взаимодействии с ферментом
(А + Ф ® АФ).
В биохимии принято называть вещества, подвергающиеся превра-щению с участием ферментов, субстратами. В ходе ферментативной реак-ции субстрат взаимодействует с молекулой фермента, образуя активиро-ванный комплекс, который называют фермент-субстратным комплек-сом. Поскольку ферменты – это белковые молекулы с высокой молеку-лярной массой и сравнительно крупными размерами, а субстраты – чаще всего низкомолекулярные вещества, при образовании фермент-субстрат-ного комплекса субстрат реагирует с определённым участком белковой мо-лекулы фермента, называемым каталитическим, или активным центром.
В процессе образования фермент-субстратного комплекса фермент оказывает активирующее воздействие на молекулу субстрата, в результате чего возрастает его реакционная способность и он легко превращается в продукты реакции. При этом молекула фермента высвобождается и затем может реагировать с новой молекулой субстрата. Образование и распад фермент-субстратного комплекса происходит очень быстро, обеспечивая высокую скорость ферментативного превращения.
Активный центр фермента обычно включает от 3 до 12 аминокислот-ных остатков, находящихся в разных участках аминокислотной последова-тельности первичной структуры ферментного белка, но сближающихся в пространстве при формировании третичной структуры (рис. 2.3). Однако строгой границы, отделяющей активный центр от остальной части моле-кулы фермента, не существует, так как образующие его аминокислотные остатки являются неотъемлемой частью общей структуры ферментного белка.
В активном центре фермента имеются группировки, ответственные за связывание субстрата и образование фермент-субстратного комплекса, но вместе с тем они также обеспечивают правильную пространственную ориентацию молекулы субстрата по отношению к другим группировкам активного центра, участвующим в превращении субстрата. При этом про-исходит совместное и кооперативное действие на субстрат всех функци-ональных группировок активного центра.
Рис. 2.3. Схематическое изображение молекулы субстрата
(заштрихована) в активном центре фермента
Соответствующими числами отмечены аминокислотные остатки каталитическо-го центра, занимающие разное положение в полипептидной цепи, но сближающи-еся в пространстве при формировании третичной структуры ферментного белка
В процессе образования фермент-субстратного комплекса происхо-дит очень точное распознавание ферментом молекул субстрата вследствие того, что поверхности молекул субстрата и каталитического центра фер-мента комплементарны, т. е. субстрат по своей пространственной кон-фигурации структурно совместим с каталитическим центром фермента. Такое структурное соответствие между ферментом и субстратом хорошо объясняется гипотезой замка и ключа, согласно которой субстрат по фор-ме так подходит к активному центру фермента, как ключ к замку. При этом субстрат сравнивается с ключом, а фермент – с замком. Из огромного разнообразия химических веществ, содержащихся в клетках живого организма, только субстрат способен связываться с активным центром фермента.
Обычно фермент катализирует превращение группы структурно родственных соединений. Например, липаза катализирует гидролитичес-кое расщепление различных сложных эфиров глицерина, входящих в сос-тав жиров; пепсин – гидролиз различных белков; амилазы – гидролиз полисахаридов крахмала; нуклеотидазы – расщепление нуклеотидов. Однако известны ферменты, обладающие очень узкой специфичностью действия. Например, каталаза катализирует превращение только пероксида водорода, уреаза – гидролиз мочевины, сукцинатдегидрогеназа – отщеп-ление водорода от молекул янтарной кислоты (сукцината).
Очень важное свойство ферментов – их стереохимическая специфич-ность. В целом ряде опытов было чётко показано, что ферменты способны распознавать не только геометрию субстрата, но также правую и левую стороны его молекулы или даже атомы водорода в составе СН2-группы, по-разному ориентированные в пространстве. Поэтому каждый фермент катализирует превращение только определённых стереоизомеров органи-ческих веществ. Это имеет важное биологическое значение. Как указыва-лось ранее, в организмах синтезируются преимущественно D-формы моно-сахаридов и L-формы аминокислот, в связи с чем именно эти стереоизо-меры указанных соединений могут служить субстратами для ферментов, тогда как другие стереоизомеры не могут превращаться ферментами орга-низма.
Изучение ферментативных реакций показывает, что специфичность действия ферментов выражается не только в комплементарном связывании субстратов, но и направленном их превращении в определённые продукты реакции, так как из одного и того же субстрата могут быть получены раз-ные вещества. Таким образом, в ходе превращения фермент специфически связывает субстрат и одновременно определяет направление биохимичес-кой реакции.
В процессе образования фермент-субстратного комплекса активные радикалы аминокислотных остатков, находящиеся в каталитическом цен-тре фермента, определённым образом воздействуют на молекулу суб-страта. При этом возможны поляризация и растяжение связей, ионизация отдельных группировок и их смещение в пространстве, что создает напря-жение в молекуле субстрата, вызывающее перестройку её структуры, в результате чего молекула субстрата переходит в активированное состоя-ние и легко подвергается превращению. Образующиеся продукты уже не имеют структурного сродства с активным центром фермента и вытесняя-ются новыми молекулами субстрата.
Чаще всего между субстратом и группировками активного центра фермента происходят электростатические и гидрофобные взаимодействия, поэтому образование фермент-субстратного комплекса представляет собой легкообратимый процесс, что способствует быстрому прохождению фер-ментативного превращения. Однако в ряде ферментативных реакций груп-пировки активного центра образуют ковалентные связи с молекулами субстратов, переводя их в более реакционноспособное состояние. Так, например, действуют ферменты, катализирующие реакции нуклеофиль-ного замещения, в ходе которых осуществляется перенос метильных, ацильных и фосфатных групп, остатков моносахаридов, аминокислот, нуклеотидов.
В некоторых реакциях ведущим фактором перевода субстрата в активированное состояние является дегидратация, т. е. создание в актив-ном центре фермента такой внутренней среды, которая лишает субстрат контакта с молекулами воды, препятствующими прохождению данной ферментативной реакции.
При взаимодействии фермента с субстратом происходят конформа-ционные изменения не только молекулы субстрата, но и белка-фермента. Такой тип взаимодействия объясняется гипотезой индуцированного соот-ветствия, согласно которой предполагается, что в ходе образования фер-мент-субстратного комплекса аминокислотные остатки в активном центре фермента приобретают более оптимальную пространственную ориента-цию, которая позволяет ферменту наиболее эффективно выполнять катали-тическую функцию. Очень часто в процессе взаимодействия с субстратом аминокислотные радикалы фермента определённым образом укладывают-ся вокруг молекулы субстрата, создавая в активном центре специфическую внутреннюю среду, способствующую активации субстрата и ускорению его превращения в продукты реакции.
В состав каталитического центра ферментных белков входят ради-калы аминокислот, содержащих реакционноспособные группировки, ко-торые могут быть донорами или акцепторами протонов. С их участием инициируется отщепление и присоединение протонов к молекуле субстра-та или происходит перенос протонов, в результате чего изменяются состо-яние ионизации молекулы субстрата и её кислотно-основные свойства и таким образом усиливается реакционная способность субстрата.
Донорами протонов в составе аминокислотных радикалов являются группировки, у которых атомы водорода соединены с электроотри-цательными атомами (O, N, S), или группировки, присоединившие протон: –COOH, –CH2OH, –С₆Н₄OH (радикал фенола), –SH, –NH3+, =NH2+, =NH+–. Акцепторами протонов могут служить следующие функциональные груп-пы: –СОО‾, –NH2, =NH, =N –.
Носителями указанных реакционноспособных групп в молекуле белка–фермента служат радикалы моноаминодикарбоновых и диамино-монокарбоновых кислот, серина, цистеина, тирозина, гистидина, трипто-фана.
У многих ферментов в составе каталитического центра имеются не только реакционноспособные радикалы аминокислотных остатков, но и дополнительные активные группировки неаминокислотной природы, присутствие которых строго необходимо для выполнения ферментом его каталитической функции. В соответствии с наличием или отсутствием в активном центре фермента дополнительной активной группировки неами-нокислотной природы молекулы фермента называют однокомпонентными или двухкомпонентными. У однокомпонентных ферментов каталитичес-кий центр образуется только из аминокислотных остатков белка и не со-держит каких-либо других небелковых компонентов. У двухкомпонентных ферментов в структуре активного центра имеется небелковая группировка, которая или непосредственно взаимодействует с субстратом, или воздей-ствует на структуру каталитического центра, переводя его в активное состояние.