2.2.4. Изоферменты

Большинство ферментов представлены в клетках организма в виде

множественных молекулярных форм, называемых изоферментами или изо-энзимами. Изоферменты – это сходные по структуре белковые молекулы, способные катализировать одну и ту же биохимическую реакцию, но раз-личающиеся по первичной структуре входящих в их состав полипептидов. Они имеют одинаковую структуру каталитического центра, вследствие чего обладают одним типом субстратной специфичности. Изоферменты одного и того же фермента отличаются оптимумами рН, температуры, других условий внешней среды, их молярной активностью, но все они катализируют одну и ту же биохимическую реакцию. Когда из клеток ор-ганизма выделяют какой-либо фермент и определяют его активность, всег-да имеют дело с его конкретными изоферментами.

Молекулы ферментов чаще всего представляют собой олигомеры, построенные из двух или нескольких полипептидов, которые в той или иной степени различаются первичными структурами, но имеют однотип-ную третичную структуру и поэтому при взаимодействии образуют функ-ционально родственные белки. Как было показано ранее, различающиеся первичными структурами полипептиды в составе олигомерных молекул кодируются разными генами, поэтому природа и набор изоферментов определяются генотипом организма.

Впервые механизм образования изоферментов был выяснен при изучении множественных молекулярных форм фермента лактатдегидро-геназы, катализирующего в клетках человека и животных превращение молочной кислоты в пировиноградную:

-2Н

СН₃ – СН(ОН) – СООН ¾® СН₃–СО–СООН

В ходе исследований были выделены кристаллические препараты лактатдегидрогеназы из клеток печени, сердечной мышцы и скелетных мышц и подвергнуты разделению методом электрофореза в полиакрил-амидном геле в щелочной буферной системе (рН 8,8). В таких условиях молекулы фермента имеют отрицательный заряд и в зависимости от величины заряда проявляют разную подвижность в направлении к аноду. В процессе электрофоретического разделения было выделено пять белковых фракций, каждая из которых представляла собой тетрамерные молекулы с молекулярной массой около 140 тыс., образованные из различных комби-наций двух типов полипептидов, обозначаемых Н и М. Полипептиды Н наиболее активно синтезируются в сердечной мышце и печени и содержат в своем составе больше остатков моноаминодикарбоновых кислот. Поли-пептиды второго типа (М) синтезируются преимущественно в скелетных мышцах и характеризуются меньшим содержанием дикарбоновых амино-кислот. С участием указанных типов полипептидов образуется пять разно-видностей ферментных молекул, являющихся изоферментами лактат-дегидрогеназы: Н₄, Н₃М, Н₂М₂, НМ₃, М₄. Каждая молекула изофермента, как тетрамер, состоит из 4 полипептидов, которые могут быть идентич-ными (Н₄ и М₄) или разными (Н₃М, Н₂М₂, НМ₃). Количественное содер-жание каждого изофермента в данной ткани зависит от концентрации в ней полипептидов Н и М.

Вследствие того что полипептиды Н содержат в своём составе больше остатков дикарбоновых аминокислот, тетрамер Н₄ при рН 8,8 среды имеет наибольший отрицательный заряд, поэтому быстрее движется к аноду в процессе электрофореза (рис. 2.6).

Тетрамер М₄ характеризуется наименьшей подвижностью к аноду, так как его молекулы построены из полипептидов с меньшим содержанием дикарбоновых аминокислот. Другие изоферменты распределяются при электрофорезе между фракциями Н₄ и М₄ в зависимости от числа полипеп-тидов Н и М в их молекулах.

Рис. 2.6. Электрофореграмма изоферментов

лактатдегидрогеназы при разделении в

щелочной буферной системе (рН 8,8)

Из примера с лактатдегидрогиназой следует, что если молекула фермента – тетрамер, образованный из двух типов полипептидов, то возни-кают пять изоферментов. Но если молекулы тетрамерного фермента фор-мируются из трёх типов полипептидов, например А, Б и В, то возможны следующие комбинации полипептидов в молекуле: А₄, Б₄, В₄, А₃Б, А₃В, А₂Б₂, А₂В₂, А₂БВ, АБ₃, АВ₃, АБ₂В, АБВ₂, Б₃В, В₃Б, Б₂В₂. Из этого примера видно, что набор изоферментов заметно возрастает при увеличении числа разных полипептидов, из которых строятся молекулы белка-фермента. На-бор изоферментов также увеличивается при возрастании степени олиго-мерности молекулы фермента. Так, у лактатдегидрогиназы из двух разных полипептидов строятся тетрамерные молекулы и возникают 5 изофермен-тов, а у гексамерного белка из двух типов полипептидов образуются уже семь изоферментов, у октамерного белка – девять и т.д.

Поскольку изоферменты – это определенный набор белковых моле-кул, способных катализировать превращение одного и того же субстрата, для их выявления используют методы разделения, принятые для белков, с последующим определением каталитической активности. Наиболее часто для разделения изоферментов применяют метод электрофореза в поли-акриламидном геле, который по сравнению с другими методами имеет наиболее высокую разрешающую способность.

Особенно большое разнообразие множественных молекулярных форм наблюдается у растительных ферментов. Практически каждый фер-мент представлен в растении в виде набора изоферментов, каждый из кото-рых проявляет каталитическую активность в строго определённых услови-ях, зависящих от параментров внутренней физиологической среды, что позволяет организму обеспечивать специфичность обмена веществ в дан-ном органе, ткани или внутриклеточном компартменте (межмембранном отсеке). Так, например, в листьях и корнях растений разная физиологи-ческая среда, но в них может проходить одна и та же биохимическая реакция за счёт того, что её катализируют разные изоферменты данного фермента. В процессе роста и развития растений постоянно изменяются внутренняя физиологическая среда и внешние условия, в соответствии с этим изменяется и набор изоферментов каждого фермента. Особенно заметно наблюдаются качественные и количественные изменения состава изоферментов при созревании и прорастании семян.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при анализе сведе-ний об изоферментах необходимо учитывать возраст и физиологическое состояние растений, а также обязательно знать, из какого органа, ткани или внутриклеточного компартмента они выделены.

Наличие в клетках организма множественных молекулярных форм одного и того же фермента, проявляющих каталитическую активность при разных физиологических условиях, позволяет организму осуществлять с необходимой интенсивностью биохимические процессы при изменении ус-ловий внешней среды. При изменении внешних условий они становятся неблагоприятными для проявления каталитической активности опреде-лённых изоферментов, но биохимическая реакция не прекращается, так как вступают в действие другие изоферменты, которые способны катализи-ровать данное превращение в изменившихся условиях. Если появляется новый изофермент, то он расширяет диапазон выживаемости организма. Чем больше набор изоферментов, тем шире диапазон их действия и лабильнее адаптация организма к неблагоприятным факторам внешней среды.

Изучение ферментных систем растений показывает, что специфич-ность обмена веществ у разных генотипов обеспечивается характерным для каждого генотипа набором изоферментов. Чем ближе генотипы расте-ний в систематическом отношении, тем меньше различается у них изо-ферментный состав ферментов. В связи с этим изоферментный анализ довольно успешно применяется для уточнения систематики живых орга-низмов, выявления филогенетического родства между видами и сортами растений, а также проверки генетической чистоты или, наоборот, гене-тического разнообразия растительной популяции.