1.2.5. Количественное определение методом тсх

Количественная ТСХ включает в себя два одинаково важных этапа: разделение смеси веществ и их количественное определение. Количественное определение химически чистых веществ в общем достаточно несложно. Смеси предварительно разделяют на составляющие компоненты, причем количественно, или по крайней мере воспроизводимо, и после разделения проводят количественный анализ. В ТСХ эти операции удачным образом совмещаются в едином процессе, поэтому для анализа требуется от нескольких микрограмм до нескольких нанограмм образца. Хроматографию на пластинках проводят в очень мягких условиях, что позволяет анализировать нестойкие вещества, не переносящие длительных манипуляций.

*

Полуколичественный анализ может быть выполнен сравнительно быстро с использованием простых процессов и несложных приборов. Для строгого количественного анализа необходимы дорогостоящие аппликаторы и точная измерительная аппаратура. Для стандартных пластинок объем пробы должен составлять 0,5-2 мкл., для ВЭТСХ-пластинок – не превышать 0,1 мкл.

Количество вещества в одном пятне должно быть минимальным, поскольку при местной перегрузке разрешение снижается. Для стандартных пластинок верхний предел нагрузки на пятно должен составлять 0,5-2 мкл, для ВЭТСХ-пластинок 0,1 мкл.

Расстояние старт-фронт для стандартных пластинок должно составлять 10-15 см, для ВЭТСХ-пластинок – 3-5 см. Превышение указанного расстояния снижает качество разделения, так как выгода oт увеличения числа теоретических тарелок сводится на нет за счет диффузии.

Работу в_ТСХ можно проводить при помощи простейших приемов (рис. 4).

Рис 4. Порядок выполнения операций: 1 – нанесение пробы,

2 – разделение, 3 – вырезание зон, 4 – элюирование, 5 – анализ

Методы ТСХ позволяют анализировать одновременно несколько образцов. Для нанесения пробы необходимо иметь шприцы с регулируемым объемом от 100 нл до 1 мкл. или же располагать аппликаторами. В случае ВЭТСХ-пластинок, при условии воспроизводимого нанесения точных объемов пробы, можно обойтись и без аппликаторов.

1.2.5.1. Полуколичественный анализ

Метод сравнения. Готовят серию стандартных растворов различной концентрации (например 1, 2, 4, 8 ... мг/мл). Наносят их с определенными интервалами на пластинку (по 2 мкл.), в промежутки между ними нанося пробу (раствор определенной концентрации). После проявления хроматограммы сравнивают интенсивность окраски и размеры пятен и на этом основании оценивают концентрацию анализируемого вещества.

М етод определения размеров пятен. Существует зависимость: при одинаковых размерах стартовых пятен (после проведения разделения методом ТСХ): корень квадратный из площади пятна F пропорционален логарифму концентрации вещества в пятне С, то есть √F ~ lg C

На основании этой зависимости строят калибровочную кривую для серии стандартных растворов. На оси абсцисс откладывают значение lg С, на оси ординат значение корня квадратного из площади пятен стандартных растворов.

Рис. 5. Калибровочныи график: