Методы специфической индикации

Анализ материалов пробы с помощью метода флюоресцирующих антител (МФА)

Метод флюоресцирующих антител, выгодно сочетающий принципы иммунологического и морфологического исследо­ваний с люминесцентным анализом, отличается высокой чув­ствительностью и специфичностью. В основе его лежит реак­ция между искомым антигеном и люминесцирующим имму­ноглобулином, меченым специальными красителями - флюо­рохромами. Образующийся в результате такой реакции ком­плекс антиген + флюоресцирующее антитело приобретает способность светиться в синих и ультрафиолетовых лучах спектра.

Основным преимуществом МФА является возможность быстрого выявления, изучения локализации и идентифика­ции возбудителей бактериальных, риккетсиозных, вирусных, грибковых инфекций и их антигенов в препаратах, окрашен­ных гомологичными флюоресцирующими иммуноглобулина­ми. МФА в течение 1-2 ч позволяет обнаруживать не толь­ко жизнеспособные особи возбудителей, но и мертвые клет­ки, содержащиеся в препарате.

Для специфической индикации применяют прямой метод флюоресцирующих антител в сочетании с контрастированием неспецифического свечения. С этой целью для окраски маз­ков используют смесь, состоящую из равных объемов специ­фических флюоресцирующих антител, меченных флюоресце­ин-изотиоцианатом (излучающим зеленый цвет), и контра­стирующего альбумина нормальной сыворотки (лошадиной, бычьей, кроличьей), конъюгированного с родаминовыми кра­сителями (обладающими красной люминесценцией).

Для проведения специфической индикации с помощью прямого МФА необходимы:

- наборы сухих меченных флюоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ) иммуноглобулинов;

- сухой сывороточный альбумин, меченный производны­ми родамина;

- химически чистый ацетон или этиловый спирт для фик­сации мазков;

- 0,01 М фосфатный буферный раствор (рН 7,2-7,4) с 0,87% хлорида натрия для отбывания препаратов в процессе их обработки люминесцирующими иммуноглобулинами;

- дистиллированная вода (нейтральной рН) для раство­рения сухих люминесцирующих конъюгатов и отмывания окрашенных мазков;

- 0,15 М (изотонический) - раствор хлорида натрия для приготовления рабочих разведении люминесцирующих конъ­югатов;

- нелюминесцирующее иммерсионное масло (или диме­тилфталат) и трис-глицериновая смесь для люминесцентной микроскопии;

- предметные и покровные стекла для приготовления мазков и препаратов для микроскопии;

- батарейные стаканчики для фиксации и отмывки окра­шенных препаратов;

- кюветы с крышками (влажные камеры) или чашки Петри для окраски мазков люминесцирующими иммуногло­булинами;

- пробирки, пипетки и прочая посуда для подготовки рабочих разведении люминесцирующих конъюгатов и обра­ботки ими мазков;

- люминесцентный микроскоп с источником питания. До начала работы люминесцирующие иммуноглобулины и контрастирующий альбумин растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке ампулы (обычно в 0,5 мл). К использованию пригодны лишь те конъюгаты, ко­торые легко и без осадка растворяются в течение 1-2 мин. Растворенные конъюгаты можно хранить при 2-4⁰С в те­чение нескольких недель плотно закрытыми.

Окраску мазков производят так называемой рабочей смесью конъюгатов, которую также готовят заблаговремен­но, но срок ее хранения при 2-4⁰С не должен превышать семи дней.

Важнейшим условием правильного составления рабочей смеси конъюгатов является оптимальный подбор в ней со­отношения люминесцирующего иммуноглобулина, меченного ФИТЦ, и альбумина, меченного производными родамина. Это достигается титрованием люминесцирующих конъюгатов на контрольных мазках, содержащих гомологичные люми­несцирующим иммуноглобулином микроорганизмы или их антигены (диагностикумы и т. п.).

Прежде всего, определяют красящий титр контрастирую­щего альбумина (табл. 1). Для этого из исходного раствора люминесцирующего альбумина готовят ряд двукратных разведений на забуференном изотоническом растворе. Затем полученные разведения наносят на мазки и инкубируют стекла с мазками во влажной камере при температуре 37⁰С в течение 30 мин. Далее мазки дважды (каждый раз по 5 мин) отмывают забуференным изотоническим раствором и ополаскивают дистиллированной водой. После высушивания на воздухе мазки подвергают люминесцентной микроскопии.

Таблица 1

Пример титрования люминесцирующего альбумина

Препараты	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	Красящий титр	Рабочее разведение
Мазок-отпечаток с тампона	+++*	+++	+++	+++	++**	- ***	1:64	1:32
Мазок-отпечаток селезенки мыши	+++	+++	+++	++	-	-	1:32	1:16
Перевиваемые клетки амниона человека	+++	+++	+++	++	+ ****	-	1:64	1:32

* + + + - отчетливо выраженное оранжево-красное или красно-бурое свечение;

** + + - красное свечение различных оттенков;

*** + - серо-желтое (бурое) свечение;

**** - - свечение отсутствует.

За красящий титр альбумина, меченного родамином, при­нимают то максимальное разведение конъюгата, которое обусловливает оранжево-красное свечение элементов мазка интенсивностью 1-2 креста. Рабочее разведение контрастирующего альбумина в 2 раза концентрированнее его крася­щего титра.

На следующем этапе определяют красящий титр люми­несцирующего иммуноглобулина в присутствии красящего альбумина. Для этого двукратные разведения испытуемого люминесцирующего иммуноглобулина смешивают с равными объемами контрастирующего альбумина, взятого в двойной по сравнению с его рабочим разведением концентрации. При­готовленными смесями окрашивают контрольные мазки, со­держащие гомологичные люминесцирующему иммуноглобулину антигены (табл. 2).

Таблица 2

Пример титрования люминесцирующего иммуноглобулина в присутствии альбумина

Препараты	Характерфлюоресценции	Интенсивность свечения при различных разведениях спе­цифического конъюгата в смеси с альбумином, взятом в рабочем разведении 1 : 16					Красящийтитрлюминесцирующегоиммуноглобулина	Рабочееразведениеиммуноглобулинавсмесисальбумином
		1:4	1:8	1:16	1:32	1:64
Мазокизсмыва	Специфическая зеленая	++++	++++	++++	+++	+	1:32	1:16
	Неспецифическая красная	+	++	++	++	++
Мазокотпечатокселезенки	Специфическая зеленая	++++	++++	++++	+++	++	1:32	1:16
	Неспеци­фическая красная	+	++	++	++	++
Монослойпереживаемыхклетокамнионачеловека	Специфическая зеленая	++++	++++	++	+++	+	1:32	1:16
	Неспецифическая красная	-	+	++	++	++

* Красящий титр люминесцирующего иммуноглобулина в этом при­мере равен 1:32. Однако для окраски мазков специфический конъюгат, как и контрастирующий альбумин, используется в рабочем разведении, которое должно быть в два раза концентрированнее его красящего тит­ра. Следовательно, рабочая смесь конъюгатов, выбранная на основании приведенных в данном примере результатов, должна состоять из разве­денного 1:16 специфического люминесцирующего иммуноглобулина и контрастирующего альбумина, взятого в разведении 1:17. Чтобы полу­чить в рабочей смеси эти оптимальные соотношения, оба конъюгата должны быть разведены 1:8, а затем смешаны в равных объемах.

Правильно подобранная рабочая смесь должна обеспечи­вать оранжево-красную флюоресценцию фона препарата (ге­терологичных микроорганизмов, клеточных элементов и про­чих посторонних примесей) и яркое зеленое специфическое свечение антигена, гомологичного испытуемому люминесци­рующему иммуноглобулину.

Для окраски мазков используют полигрупповые, группо- ­и видоспецифические люминесцирующие иммуноглобулины.

При исследовании мазков, приготовленных из нативного материала пробы (I и II ступени анализа), рекомендуется следующий порядок окраски.

1. При наличии полигрупповых препаратов вначале окра­шивают мазки на 1-м стекле, нанося:

- на 1-й квадрат стекла - полигрупповой бактериаль­ный люминесцирующий иммуноглобулин;

- на 2-й квадрат стекла - полигрупповой риккетсиозный люминесцирующий иммуноглобулин;

- на 3-й и 4-й квадраты - полигрупповые вирусные лю­минесцирующие иммуноглобулины (два препарата);

- на 5-й квадрат стекла - кокцидиоидозный люминесци­рующий иммуноглобулин.

Если с каким-либо полигрупповым диагностическим пре­паратом будет получен положительный результат, дополни­тельной окраске подлежат 2-е или 3-е стекло. При этом маз­ки 2-го стекла окрашивают видоспецифическими бактериаль­ными люминесцирующими иммуноглобулинами, а мазки 3-го стекла - видо- и группоспецифическими риккетсиозными или вирусными люминесцирующими иммуноглобулинами.

2. Если полигрупповые диагностические препараты отсут­ствуют то для окраски мазков сразу используют видо- и группоспецифические люминесцирующие иммуноглобулины:

- для 2-го стекла - к возбудителям чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы (универсальные или антиспоро­вые), сапа и мелиоидоза;

- для 3-го стекла - к возбудителям эпидемического сып­ного тифа, Ку-лихорадки, группы клещевых пятнистых лихо­радок, пситтакоза, оспы и кокцидиоидоза.

Резервным стеклом с мазками иммунолюминесцентного анализа остается первое.

Для окраски мазков, приготовленных из взвесей после концентрирования пробы физическими способами (III стадия анализа), в основном используют те же диагностические пре­параты, что и при исследовании мазков из нативного мате­риала. Отличие состоит лишь в том, что из анализа исклю­чаются вирусные люминесцирующие иммуноглобулины. Кро­ме того, при целенаправленном исследовании проб воды к числу бактериальных диагностических препаратов в ряде случаев может быть добавлен холерный люминесцирующий иммуноглобулин.

При окраске пластин с монослоем клеток, зараженных в целях накопления вирусов (IV стадия анализа), рекомен­дуется следующий порядок.

1. При наличии полигрупповых диагностических препара­тов вначале окрашивают пластины 1-го стекла тремя раз­личными полигрупповыми вирусными люминесцирующими иммуноглобулинами. При получении положительного резуль­тата с каким-либо полигрупповым препаратом для иденти­фикации обнаруженного вируса дополнительно окрашивают пластины с монослоем клеток на 2-м и 3-м стеклах соответ­ствующими этому полигрупповому препарату видо - и группо­специфическими люминесцирующими иммуноглобулинами.

2. Если полигрупповые диагностические препараты отсут­ствуют, то для окраски пластин с монослоем клеток сразу используют видо- и группоспецифические люминесцирующие иммуноглобулины:

- для пластин 1-го стекла - к альфавирусам, флавиру­сам и вирусу натуральной оспы;

- для пластины 2-го стекла - к аренавирусам и вирусам Марбург и Эбола;

- для пластин 3-го стекла - к вирусам конго-крымской геморрагической лихорадки и лихорадки долины Рифт.

Одна пластина 3-го стекла остается резервной на случай необходимости применения какого-либо дополнительного ди­агностического препарата. Стекла с пластинами, извлечен­ными на втором сроке, окрашивают в том же порядке.

Для окраски пластин с монослоем клеток, зараженных в целях накопления риккетсий и хламидий (IV стадия анали­за), сразу используют видо- и группоспецифические люми­несцирующие иммуноглобулины:

- для 1-й пластины - к риккетсиям эпидемического сып­ного тифа;

- для 2-й пластины - к возбудителю Ку-лихорадки;

- для 3-й пластины - к возбудителю пситтакоза.

Стекла с пластинами, извлеченными на втором сроке, окрашивают в том же порядке.

При окраске мазков-отпечатков брюшины и селезенки бе­лых мышей, использованных для биологического обогащения пробы (V стадия анализа), рекомендуется следующий поря­док.

1. При наличии полигрупповых люминесцирующих имму­ноглобулинов вначале окрашивают мазки на 1-м стекле, на­нося:

- на 1-й и 5-й квадраты (т. е. соответственно на отпе­чатки брюшины и селезенки) полигрупповой бактериальный диагностический препарат;

- на 2-й и 6-й квадраты - полигрупповой риккетсиозный диагностический препарат.

В случае обнаружения в окрашенных мазках бактерий для идентификации последних дополнительно окрашивают соответствующими бактериальными видоспецифическими люминесцирующими иммуноглобулинами мазки-отпечатки на 2-м и 3-м стеклах, а в случае обнаружения риккетсий - со­ответствующими риккетсиозными видо- и группоспецифически­ми диагностическими препаратами мазки-отпечатки на 4-м стекле.

2. При отсутствии полигрупповых диагностических препа­ратов для окраски мазков-отпечатков сразу используют ви­до- и группоспецифические бактериальные и риккетсиозные люминесцирующие иммуноглобулины.

Пятое стекло с отпечатками только селезенки, мышей пе­редают во 2-ю подгруппу идентификации БС, где его окра­шивают полигрупповыми люминесцирующими иммуноглобу­линами.

Для окраски мазков-отпечатков мозга мышей-сосунков, зараженных в целях накопления вирусов (V стадия анали­за), рекомендуется следующий порядок.

1. При наличии полигрупповых вирусных диагностических препаратов вначале окрашивают мазки на 1-м стекле тремя различными полигрупповыми люминесцирующими иммуно­глобулинами. В случае получения положительного результа­та с каким-либо из этих препаратов для идентификации вы­явленного вируса дополнительно окрашивают мазки-отпечат­ки на 2-м стекле соответствующими видо- и группоспецифи­ческими люминесцирующими иммуноглобулинами.

2. При отсутствии полигрупповых диагностических препа­ратов окраску сразу проводят видо- и группоспецифическими люминесцирующими иммуноглобулинами к альфавирусам, флавирусам, вирусу натуральной оспы, к вирусам Мачупо и Лаоса, вирусу Марбург, вирусу Эбола, к вирусам конго-крымской геморрагической лихорадки и лихорадки долины Рифт.

Окраска мазков и препаратов люминесцирующими имму­ноглобулинами

На фиксированные и высушенные мазки и препараты с монослоем клеточной культуры наносят пасте­ровской пипеткой рабочую смесь специфического люминесци­рующего иммуноглобулина и контрастирующего альбумина. При окраске различными по специфичности люминесцирую­щими иммуноглобулинами мазков, расположенных на одном предметном стекле, нельзя допускать слияния капель конъюгатов.

Обработку мазков конъюгатами проводят во влажной ка­мере при температуре 37⁰С в течение 20 мин.

По истечении 20 мин стекла с мазками извлекают из влажной камеры, удаляют с поверхности мазков остатки конъюгатов и отмывают мазки для удаления непрореагиро­вавших люминесцирующих иммуноглобулинов.

Отмывку мазков проводят в двух сменах (по 5 мин каж­дая) 0,01 М фосфатного буферного раствора (рН 7,2-7,4) с 0,87% хлорида натрия, после чего мазки споласкивают ди­стиллированной водой.

Люминесцентная микроскопия

Для получения правиль­ных результатов люминесцентной микроскопии необходимо до начала исследования тщательно сцентрировать всю осве­тительную систему микроскопа и подобрать опытным путем оптимальную комбинацию первичных и запирающих свето­фильтров. При использовании люминесцирующих иммуноглобулинов, меченных ФИТЦ, чаще всего применяют возбуж­дающие светофильтры СС-4, СС-8 или ФС-1, СЗС-7 в комби­нации с запирающим светофильтром типа ЖС-18.

При иммунолюминесцентном исследовании препаратов используют иммерсионные системы. При этом для выявления бактерий, риккетсий и грибов применяют масляную иммер­сию (нефлюоресцирующее иммерсионное масло или диметил­фталат). Для выявления вирусов в препаратах из клеточных культур или в мазках-отпечатках органов животных целесо­образно использовать водно-иммерсионные системы.

Нефлюоресцирующее масло (диметилфталат) наносят не­посредственно на мазок. При использовании водно-иммерси­онной системы на окрашенные препараты предварительно наносят трисглицериновую смесь, затем препарат накрыва­ют покровным стеклом, на которое сверху наносят каплю дистиллированной воды.

Для получения достоверных результатов исследования рекомендуется просматривать под микроскопом не менее 20-25 полей зрения в каждом мазке (если морфологически типичные возбудители встречаются почти в каждом поле зре­ния, можно ограничиться просмотром меньшего числа полей зрения).

Учет результатов иммунолюминесцентной микроскопии проводят визуально на основе выявления морфологических особенностей и локализации возбудителя, а также оценки ин­тенсивности и специфичности его свечения.

Оценку интенсивности специфической флюоресценции объекта проводят с учетом ее структурных особенностей по следующей схеме:

+ + + + - яркая сверкающая флюоресценция изумрудно-зеленого цвета, четко выявляются морфологи­ческие особенности микроорганизма, вокруг корпускулярных агентов может наблюдаться ярко светящийся ободок;

+ + + - яркая флюоресценция зеленого цвета, морфо­логические особенности микроорганизма выяв­ляются достаточно отчетливо, нередко хорошо видны периферические ободки;

+ + - слабая . флюоресценция желтовато-зеленого цвета, морфологические особенности микроор­ганизмов выявляются еще достаточно четко, периферические ободки почти не видны;

+ - очень слабая флюоресценция неопределенного цвета, микроорганизмы различаются с трудом;

- - флюоресценция объекта отсутствует.

Результаты иммунолюминесцентного анализа считаются положительными, если в препарате обнаруживаются, хотя бы единичные (для мелких бактерий и риккетсий - не менее 10 особей), морфологически типичные микроорганизмы или пораженные вирусом (риккетсиями, хламидиями) тканевые клетки (не менее 3-5 в препарате), специфически флюорес­цирующие на 3-4 креста при отрицательных контролях.

При исследовании любого неизвестного материала основ­ным контролем специфичности являются все остальные маз­ки данной пробы, которые оказались окрашенными гетеро­логичными по отношению к выявленному в пробе агенту лю­минесцирующими иммуноглобулинами. Наряду с этим имму­нолюминесцентный анализ должен сопровождаться микро­скопией и других препаратов, приготовленных из несодержа­щих микроорганизмы материалов (например, незараженные клеточные культуры, отпечатки органов здоровых животных и т.п.) и окрашенных теми же специфическими люминесци­рующими иммуноглобулинами. Этот контроль обязателен, прежде всего, при вирусологических исследованиях и может быть общим для всех проб на данный срок анализа.

При соблюдении всех необходимых условий приготовле­ния и окраски таких препаратов специфическая зеленая флю­оресценция во всех контрольных мазках должна полностью отсутствовать.

Анализ материалов пробы с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РИГА)

Для выявления содержащихся в пробе микроорганизмов, их антигенов и бактериальных токсинов применяют реакцию непрямой гемагглютинации с использованием иммуноглобу­линовых эритроцитарных диагностикумов.

Для постановки реакции необходимо иметь:

- эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностикум;

- иммунную сыворотку для контроля специфичности РНГА;

- изотонический раствор хлорида натрия;

- ингредиенты для приготовления разводящей жидкости (лошадиную или кроличью нормальную сыворотку).

Сухой эритроцитарный иммуноглобулиновый диагности­кум и гомологичный иммуноглобулин (иммунную сыворотку), а также ингредиенты для приготовления разводящей жидко­сти растворяют и подготавливают к реакции в точном соот­ветствии с наставлением по применению данного диагности­ческого препарата.

В зависимости от характера жидкой фазы пробы иссле­дуемый материал либо сразу используют в реакции, либо подвергают предварительной дополнительной обработке. В частности, в суспензии, приготовленные из органов и тка­ней животных, членистоногих, патологического материала, полученного от больных, а также в кровь и другие биологи­ческие жидкости добавляют равный объем насыщенного раствора хлорида натрия (для устранения возможных неспе­цифических реакций). С этой же целью культуральную сре­ду из пробирок с зараженной клеточной культурой разводят в два раза изотоническим раствором хлорида натрия. К про­бам воды добавляют 9% раствор хлорида натрия в соотно­шении 1 : 10.

Постановка реакции. Исследуемый материал разливают по 0,025 мл в два параллельных ряда лунок панели микротитрато­ра с таким расчетом, чтобы на каждый определяемый антиген приходилось по две лунки. Лунки первого ряда являются опытными, второго-контрольными. В лунки второго ряда для контроля специфичности реакции добавляют по 0,025 мл специфических иммуноглобулинов (иммунные сыворотки) соответствующих эритроцитарным диагностикумам. В лунки первого ряда (для уравновешивания объемов в опытных и контрольных лунках) вносят по 0,025 мл разводящей жидко­сти.

Содержимое лунок перемешивают путем легкого постуки­вания по углам панели.

Через 10 мин в первые лунки (опытную и контрольную) вносят по 0,025 мл 1 % взвеси соответствующего иммуногло­булинового эритроцитарного диагностикума. Панели после перемешивания содержимого в лунках оставляют стоять при комнатной температуре 1-1,5 ч до полного осаждения эри­троцитов.

Помимо контроля специфичности реакция сопровождается еще двумя контролями диагностикума:

- на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов (в две лунки вносят по 0,05 мл разводящей жидкости и по 0,025 мл 1% взвеси эритроцитарного диагностикума);

- на отсутствие неспецифической агглютинации эритро­цитов в иммунной сыворотке (в две лунки вносят по 0,025мл разводящей жидкости, 0,025 мл иммунной сыворотки и 0,025 мл 1% взвеси эритроцитарного диагностикума).

Учет реакции начинают с контролей. Характер осадков эритроцитов оценивают по 4-крестовой шкале:

++++ - агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают все дно лунки, образуя по форме перевернутый купол;

+++ - по окружности равномерна агглютинировавших эритроцитов отмечается тонкое («фестон­чатое») кольцо;

++ - на фоне равномерно агглютинировавших эри­троцитов отмечается кольцо меньшего диамет­ра с более ровным краем;

+ - четкое кольцо малого диаметра на слабораз­личимом фоне агглютинировавших эритроци­тов;

- - агглютинация эритроцитов отсутствует, на дне лунки образуется маленькое кольцо с четким ровным краем или компактный диск.

Реакцию учитывают только при отсутствии гемагглютина­ции в контролях диагностикума. РНГА считают положитель­ной, если в лунках с исследуемым материалом имеется ге­магглютинация не менее чем на 3 креста при отсутствии та­ковой в тех лунках, куда был добавлен иммуноглобулин. РНГА считают отрицательной, если во всех лунках гемагглю­тинация отсутствует.

При наличии гемагглютинации как в опытной, так и конт­рольной лунке, реакцию следует повторить с разведением ис­следуемого материала 1:5 и 1:10. Если и в этом случае эритроциты также будут агглютинировать во всех лунках, реакцию считают неспецифической и ее результаты не учи­тывают.