Подготовка проб к исследованию (первичная обработка проб)

Прием и сортировку проб проводят в специально отве­денном для этого помещении или настольном боксе лабора­тории.

Сортировка проб состоит из:

- определения очередности исследования проб;

- определения возможности объединения (усреднения) проб;

- увлажнения (при необходимости) сухих материалов пробы небольшим количеством стерильного изотонического раствора хлорида натрия;

- отделения от пробы части материала, подлежащего (в случае необходимости) пересылке в лаборатории, прово­дящие индикацию в полном объеме.

В первую очередь исследованию подлежат:

- пробы воздуха;

- осколки и содержимое биологических боеприпасов;

- смывы из носоглотки людей, оказавшихся без защиты в зоне прохождения аэрозольного облака;

- материалы от внезапно заболевших людей.

Объединение этих проб не допускается. Остальные про­бы, если их раздельное исследование лаборатория обеспе­чить не может, могут быть объединены (но не более 3—5 об­разцов в одну пробу). В этих случаях объединению подле­жат только односменные пробы, взятые в одном очаге.

Каждую поступившую пробу регистрируют в специаль­ном журнале, куда вносят основные данные сопроводитель­ной записки и время доставки ее в лабораторию.

Первичная обработка пробы состоит из:

- приготовления мазков для МФА из нативных материа­лов пробы;

- перевода сухих и плотных материалов пробы в жид­кую фазу;

- концентрирования содержащихся в пробе возбудите­лей физическими (иммуносорбционными) методами.

В целях четкой организации и преемственности исследо­ваний все подлежащие анализу материалы (мазки, взвеси и т. п.) целесообразно маркировать, помимо номера пробы, римскими цифрами, обозначающими ту или иную стадию анализа:

- цифрой «I» обозначают мазки-отпечатки, приготовлен­ные из нативных материалов пробы для ее первичной обра­ботки;

- цифрой «II» обозначают мазки-отпечатки, приготов­ленные из нативной жидкой пробы или из взвеси, получен­ной после перевода пробы в жидкую фазу, а также сами на­тивные взвеси пробы;

- цифрой «III» обозначают мазки и взвеси, приготовлен­ные из материалов, пробы после ее концентрирования физи­ческими (или иммуносорбционными) способами;

- цифрой «IV» обозначают мазки и взвеси, приготовлен­ные из посевов на питательные среды, пластин с монослоем зараженной клеточной культуры и поддерживающую куль­туральную жидкость из пробирок с культурой клеток;

- цифрой «V» обозначают мазки-отпечатки и взвеси, приготовленные из органов лабораторных животных, исполь­зованных для биологического обогащения пробы,

Из нативных материалов пробы мазки готовят на трех предметных стеклах (по 8-10 мазков на каждое стекле). После фиксации в течение 15-20 мин в охлажденном аце­тоне два стекла с мазками используют для исследования, одно (резервное) хранят на холоде до конца анализа данной пробы.

Из жидких материалов пробы мазки готовят в виде ма­леньких капель, наносимых на стекло в центре каждого ква­драта бактериологической петлей, диаметром 2-3 мм.

Из плотных материалов пробы мазки готовят в виде пре­паратов-отпечатков на предметном стекле.

Из секционного материала и органов животных мазки го­товят в виде отпечатков на предметном стекле. Для этого от исследуемого органа отрезают кусочек и поверхностью среза слегка прикасаются к предметному стеклу. Если ткань орга­на чрезмерно пропитана кровью, избыток ее целесообразно удалить, вначале прикоснувшись срезом к листу фильтро­вальной бумаги.

Перевод пробы в жидкую фазу предусматривает суспен­зирование плотных (сухих) материалов в стерильном изото­ническом растворе хлорида натрия. Вначале готовят взвесь исследуемого материала в небольшом объеме изотонического раствора хлорида натрия - до 5 мл (получение так называе­мого первичного объема жидкой фазы). После того как из этой суспензии будут приготовлены мазки на предметных стеклах, ее объем доводят изотоническим раствором хлорида натрия до 22 мл (получение так называемого конечного объема жидкой фазы пробы).

При поступлении пробы в виде секционного материала или органов животных жидкую фазу получают путем гомо­генизации кусочков исследуемого материала в стерильной фарфоровой ступке. Стерильный изотонический раствор хло­рида натрия добавляют к гомогенату из расчета получения 20% взвеси.

Приготовленную тем или иным способом суспензию (ко­нечный объем жидкой фазы пробы) распределяют на порции, предназначенные:

- флакон «а» - для постановки РНГА-2 мл;

- флакон «б» - для посева на питательные среды и по­становки биопробы на токсины (заражение двух опытных мышей) - 2 мл;

- флакон «в» - для заражения четырех мышей с ослаб­ленной резистентностью к инфекции (биологическое обога­щение пробы) - 2,5 мл;

- флакон «г» - для заражения культуры клеток для на­копления риккетсий и хламидий-4 мл;

- флакон «д» - для заражения культуры клеток в целях накопления вирусов-8 мл;

- флакон «е» - остаток пробы (резерв на случай повто­рения или продолжения анализа).

Флакон «а» со взвесью, предназначенной для постановки РНГА, передают в группу индикации ВС без дополнительной обработки.

Флакон «б» со взвесью, предназначенной для обогащения пробы на питательных средах и постановки биопробы на токсин, передают в первую подгруппу идентификации ВС также без дополнительной обработки.

Во флакон «в» со взвесью, предназначенной для биоло­гического обогащения пробы на белых мышах с ослабленной к инфекции резистентностью, добавляют 2,5 мл поливалент­ной противоботулинической сыворотки, содержащей 100 - 200 ед/мл антитоксинов к ботулиническим токсинам типов А, В, Е. Смесь пробы с противоботулиническими сыворотка­ми выдерживают 10-15 мин при комнатной температуре, а затем используют для заражения четырех белых мышей.

Во флакон «г» со взвесью, предназначенной для накоп­ления на культуре клеток, содержащихся в пробе риккетсий и хламидий, добавляют 0,1 мл стерильной сыворотки круп­ного рогатого скота и 0,1 мл смеси растворов антибиотиков, содержащей 4000 ЕД/мл пенициллина и 2000 ЕД/мл стрепто­мицина. После этого флакон «г» передают во вторую под­группу идентификации БС.

Во флакон «д» со взвесью, предназначенной для накоп­ления содержащихся в пробе вирусов, добавляют 0,1 мл сме­си растворов антибиотиков, содержащей 80000 ЕД/мл пени­циллина и 40000 ЕД/мл стрептомицина. После этого флакон «д» передают во вторую подгруппу идентификации БС, про­водящую биологическое обогащение материалов проб на кле­точных культурах.

Флакон «е» с остатками жидкой фазы пробы хранят в группе первичной обработки проб при температуре 2-4⁰ С до окончания анализа данной пробы и используют при необ­ходимости для повторения или продолжения исследования.

Концентрирование возбудителей в пробе физическими (иммуносорбционными) методами

Концентрирование в пробе возбудителей (бактерий, рик­кетсий) физическими методами проводят чаще всего путем фильтрования жидкой пробы через мембранные фильтры. Этот способ обогащения применяют в том случае, когда объ­ем доставленной пробы, превышает 50 мл. Для фильтрования используют мембранные фильтры № 3, предварительно про­кипяченные в дистиллированной воде.

Иммуносорбционное концентрирование в пробе БС мо­жет быть проведено при наличии в лаборатории соответст­вующих иммуносорбентов. Сортированные на иммуносорбен­те возбудители выявляются в дальнейшем с помощью МФА.

Биологическое обогащение проб на питательных средах

Для накопления содержащихся в пробе бактерий и пос­ледующего их исследования производят посев на питатель­ные среды:

- агар Хоттингера с генциановым фиолетовым и стиму­лятором роста чумного микроба или дрожжевой агар на ос­нове пептона Д с генциановым фиолетовым (.посев произво­дят на 2 чашки при температуре 37 и 28⁰ С);

- 2% мясопептонный агар Хоттингера с нанесенной па поверхность среды желточной эмульсией или дрожжевой агар на основе пептона Д с добавлением 0,2 мл 10% раствора фенолфталеинфосфата натрия (для исследования на возбу­дителя сибирской язвы);

- агар Хоттингера с 5% яичного желтка или агар на ос­нове пептона Д с цистином, глюкозой и дефибринированной кровью (для исследования на возбудителя туляремии);

- агар Хоттингера с 5% глицерина или дрожжевой агар с генциановым фиолетовым на основе пептона Д, 2% глице­рина и 1 % глюкозы (для исследования на возбудителя бру­целлеза );

- агар Хоттингера с 5% глицерина или дрожжевой агар на основе пептона Д с 5% глицерина, 10 ЕД/мл пенициллина и 25 ЕД/мл полимиксина (для исследования на возбудите­лей сапа и мелиоидоза).

Посев производят на предварительно подсушенные чашки Петри с питательными средами, шприцем наносят по 0,05 мл (1-2 капли) исследуемой взвеси. Нанесенный материал тща­тельно растирают по поверхности среды шпателем (одним для всех чашек данной пробы). Материалом каждой пробы засевают 6 чашек: 5 чашек с посевами помещают в термо­стат с температурой 37⁰С, одну чашку (с посевом для обна­ружения возбудителя чумы) инкубируют при температуре 28⁰С.

В процессе инкубации чашки с посевами просматривают через 12, 18, 24, 30, 36 и 44 ч.

При наличии подозрительного роста часть посева (отдель­ные колонии или «газон») снимают бактериологической пет­лей и готовят мазки на двух стеклах для исследования с по­мощью МФА. Одновременно с этим готовят также взвесь на стерильном изотоническом растворе хлорида натрия для ис­следования в РНГА.

Для накопления возбудителей системных микозов иссле­дуемый материал засевают на дрожжевой агар на основе пептона Д или элективную среду с антибиотиками. В зави­симости от концентрации клеток грибов в исследуемой пробе рост возбудителя в виде молодого мицелия может быть вы­явлен с помощью МФА через 2-3 сут.

Постановка биопробы на ботулинический токсин

Биопробу на ботулинический токсин ставят на белых мы­шах массой 16-18г. С этой целью двум мышам вводят внутрибрюшинно по 0,5мл нативного материала пробы из флакона «б». Контрольными животными в опыте служат че­тыре белых мыши, предназначенные для биологического обо­гащения пробы, которым исследуемый материал вводится в смеси с поливалентной противоботулинической сывороткой.

Для выявления признаков отравления животных ботули­ническим токсином (парез задних конечностей, «осиная та­лия» вследствие паралича диафрагмы, редкое дыхание) за ними устанавливают систематическое наблюдение в течение 44-48ч.

Биологическое обогащение пробы в организме белых мышей

Для биологического обогащения содержащихся в пробе бактерий, риккетсий, хламидий, вирусов используют четы­рех белых мышей массой 16-18г, у которых предваритель­но ослаблена резистентность к инфекции. Последнее дости­гается путем внутримышечного введения в заднюю лапку 5 мг гидрокортизона (0,2мл ацетатной взвеси коммерческо­го препарата, содержащего 25мг гидрокортизона в 1 мл) за 4-5 ч до заражения животных исследуемым материалом.

Подготовленным таким образом белым мышам (4 мыши на пробу) вводят внутрибрюшинно по 1мл пробы с поли­валентной противоботулинической сывороткой (из флакона «в»).

За зараженными животными наблюдают в течение 44 ч. Павших мышей вскрывают немедленно, живых убивают эфи­ром в два срока: через 24 и 44 ч после заражения (по две мыши на срок).

Для исследования с помощью МФА у каждой вскрывае­мой мыши отрезают маленькие кусочки брюшины и селезен­ки и готовят ими мазки-отпечатки на пяти разграфленных на 8 квадратов предметных стеклах:

- на 1-м, 2-м, 3-м и 4-м стеклах - мазки-отпечатки брю­шины (верхний ряд квадратов) и мазки-отпечатки селезенки (нижний ряд квадратов);

- на 5-м стекле - только мазки-отпечатки селезенки (верхний и нижний ряды).

Всего таким образом от каждой мыши готовят по 16 от­печатков брюшины и 22 отпечатка селезенки.

Извлеченные из мышей селезенки помещают в стериль­ные пенициллиновые флаконы и хранят при температуре 2-4⁰С до конца исследования данной пробы.

При наличии в лаборатории мышей-сосунков их исполь­зуют для накопления содержащихся в пробе вирусов. Инфи­цирующим материалом служит взвесь пробы из флакона «д», которую вводят по 0,01 мл в мозг 1-2 - дневным мышам из одной семьи (для одной пробы используют 5-7 сосун­ков).

Вскрытие мышей производят через 24-44 ч. У каждого животного извлекают мозг и готовят из него мазки-отпечатки на 2-3 предметных стеклах. При необходимости из мозга готовят взвеси на изотоническом растворе хлорида натрия для исследования с помощью РНГА.

Биологическое обогащение пробы в культуре клеток

Культуры клеток (линии: ВНК-21 - клетки почек одно­дневного сирийского хомячка; Verо-клетки почек африкан­ской зеленой мартышки; LLС-МК₂ - клетки почек макаки резус) используют для биологического накопления в пробе вирусов, риккетсий и хламидий. Учитывая биологические осо­бенности указанных групп возбудителей, исследование про­водят раздельно: в отношении вирусов и в отношении рик­кетсий и хламидий.

Биологическое накопление вирусов

Материалом для заражения культуры клеток служит взвесь пробы из флакона «Д». Эта взвесь перед заражением клеток должна быть выдержана в холодильнике при 2-4⁰С не менее часа (контакт пробы с антибиотиками). Для выяв­ления большинства видов вирусов исследуемым материалом заражают 18 пробирок с монослоем клеток на пластинках.

Методика заражения клеточных культур состоит в сле­дующем:

- удаляют из пробирок с клеточной культурой ростовую среду;

- вносят в пробирки исследуемый материал (инокулят) в объеме 0,2мл;

- выдерживают пробирки в наклоненном положении в течение часа при комнатной температуре (контакт инокулята с клетками);

- полностью удаляют ипокулят из пробирок и однократ­но отмывают зараженные клетки 1,5 мл солевого раствора Хенкса или поддерживающей среды;

- вносят в пробирки по 1 мл поддерживающей среды. Пробирки с зараженной культурой клеток инкубируют а термостате при температуре 37⁰С в течение 44 (72)ч. Через 24 и 44 (72)ч из пробирок извлекают пластины с монослоем клеток для исследования с помощью МФА (по 9 пластинок на каждом сроке). Отмытые и высушенные пластины при­клеивают затем на три предметных стекла (по три пластины на каждом) и фиксируют в охлажденном ацетоне.

Остающаяся в пробирках после извлечения пластин куль­туральная жидкость может быть использована при необхо­димости для постановки РНГА.

Извлечение пластин с монослоем зараженных клеток про­водят с соблюдением правил асептики и требований проти­воэпидемического режима. Для извлечения пластин из про­бирок используют длинную пастеровскую пипетку, капилляр которой запаян и изогнут в виде короткого крючка. Извле­ченные из пробирок пластины однократно промывают изото­ническим раствором хлорида натрия и размещают в наклон­ном положении (клеточным слоем сверху) на листе фильтро­вальной бумаги, сложенной в виде «гармошки», и оставляют при комнатной температуре до полного высыхания клеточ­ного слоя. Высохшие пластины приклеивают одним концом на предметное стекло клеем № 88.

После высыхания клея предметные стекла погружают в охлажденный химически чистый ацетон и фиксируют в нем в течение 15 мин при 2-4⁰С.

Биологическое накопление риккетсий и хламидий

Материалом для заражения клеточных культур служит взвесь пробы из флакона «г». Эта взвесь перед заражением культуры клеток должна быть выдержана в холодильнике при 2-4⁰С не менее одного часа (контакт пробы с антибио­тиками).

Для выявления основных видов риккетсий и хламидий исследуемым материалом заражают 8 пробирок с монослоем клеток на пластинах. Для этого из пробирок с клеточной культурой удаляют ростовую среду, вносят в пробирки ис­следуемый материал (инокулят) в объеме 0,2мл, инкубиру­ют пробирки в наклонном положении в термостате при тем­пературе 37⁰С в течение 1,5-2 ч (контакт инокулята с клет­ками), полностью удаляют инокулят из пробирок и одно­кратно промывают зараженные клетки 1,5 мл «разводящей» среды. Вносят в пробирки по 1 мл поддерживающей среды с 2% сыворотки крупного рогатого скота без антибиотиков.

Пробирки с зараженной культурой клеток инкубируют в термостате при температуре 37⁰С в течение двух суток.

Через 24 и 44ч из пробирок извлекают пластины с моно­слоем клеток для исследования с помощью МФА (по 4 пла­стины на каждом сроке). Отмытые и высушенные пластины приклеивают на предметное стекло и фиксируют в охлаж­денном ацетоне.

Остающуюся в пробирках после извлечения пластин культуральную жидкость используют при необходимости для постановки РНГА.