4.5. Визначення вітаміну с в молоці.
Лабораторний посуд: колби конічні, бюретки для титрування, піпетки.
Матеріали та реактиви: 1. молоко; 2. 2,0%-й розчин соляної кислоти; 3. 0,001 н. розчин 2,6–дихлорфеноліндофенолу.
Хід роботи. У конічну колбу на 100 мл відмірюють піпеткою 5 мл молока і 10 мл дистильованої води. В дві колби на 25–50 мл вносять піпеткою по 5 мл приготовленої суміші, 9 мл дистильованої води і 1 мл 2,0%-го розчину HCl ретельно переміщують і титрують 0,001 н. розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолу до слабо–рожевого забарвлення, яке не зникає протягом 30–60 с.
Вміст аскорбінової кислоти розраховують за формулою:
де А – кількість 0,001 н. розчину 2,6–дихлорфеноліндофенолу, що пішов на титрування, мл; К – поправка на титр індикатору; 5,28 – постійний коефіцієнт.
5. Ферменти: специфічність та активність дії.
5.1. Визначення специфічності дії ферментів
Ферменти відрізняються від неорганічних каталізаторів високою специфічністю.
Під специфічністю дії ферментів розуміють відповідну спрямованість їх впливу на певний субстрат, групу субстратів, близьких за своїми властивостями, або певний тип зв’язку. Залежно від цього розрізняють абсолютну, групову і стереохімічну (просторову) специфічність ферментів.
Абсолютна специфічність - характерна для ферментів, які каталізують лише одну реакцію і діють на один точно визначений субстрат. Наприклад, уреаза діє лише на сечовину і не діє на похідні сечовини, напр. метилсечовину; аргіназа, розщепляє аргінін.
Абсолютно групова специфічність – здатність ферментів діяти на певний тип хімічного зв’язку, утворений певними радікалами (атомними групами). Так, пепсин гідролітично розщеплює пептидний звязок, утворений аміногрупами тирозину та фенілаланіну; карбоксипептидаза відщеплює в пептидах з С-кінця майже всі амінокислоти.
Відносно групова специфічність (специфічність за типом зв’язку) – здатність ферменту діяти на певний тип хімічного звязку, утворений радікалами будь-якої хімічної будови. До таких ферментів належать ліпази та естерази, що розщеплюють не тільки різні триацилгліцериди, а й ді- та моноацилгліцериди та інші складні ефіри.
Оптична або стереохімічна специфічність – здатність ферменту діяти лише на одину стереоізомерну форму субстрату. Так, -Д-глюкозооксидаза, діє лише на -Д-глюкозу.
Специфічність ферментів можна спостерігати на прикладі уреази, амілази і пепсину.
Принцип методу. Під дією уреази на сечовину утворюється двооксид вуглецю та аміак, який зміщує реакцію середовища в лужних бік, що визначають з допомогою індикатору фенолфталеїну.
Амілази каталізують гідролітичне розщеплення крохмалю до мальтози і декстринів. Найбільш вивченими є α і β–амілази: α–амілаза розщеплює амілозу і амілопектин безладно на велику кількість низькомолекулярних декстринів та незначну кількість мальтози; β–амілаза каталізує гідролітичне розщеплення кожного другого глікозидного зв'язку амілози з утворенням 100% мальтози і розщепленням кожного другого глікозидного зв'язку амілопектину до розгалуження з утворенням мальтози і незначної кількості високомолекулярних декстринів. Таким чином, дію амілази можна визначити за зникненням синього забарвлення розчину крохмалю в присутності йоду.
Пепсин каталізує гідролітичне розщеплення пептидних зв’язків білків молока, що зумовлює його зсідання.
Хід роботи. Готують дев’ять чистих пробірок. В перші три наливають по 5 мл 0,1%-го розчину крохмалю, у наступні три – по 5 мл 1,0%-го розчину сечовини і по 3 краплі 1,0%-го розчину фенолфталеїну, а в решту пробірок – по 5 мл молока. Пробірки групують по три. В кожній трійці знаходяться пробірки з різним субстратом – з крохмалем, сечовиною і молоком. В першу трійку вносять по 1 мл уреази, в другу – по 1 мл розчину амілази, в третю по 1 мл 1,0%-го розчину пепсину. Всі пробірки витримують протягом 15 хв. при 37 °С, після чого перевіряють у них дію ферментів. У пробірки з крохмалем додають по краплинах 1,0%-й розчин йоду в йодиді калію. Відмічають зміну забарвлення в пробірках з крохмалем і сечовиною під дією відповідно амілази та уреази.
Реактиви: 1. 0,1%-й розчин крохмалю; 2. 1,0%-й розчин пепсину; 3. Розчин уреази, 4. Амілаза солоду або розбавленої водою слини (1:20); 5. 1,0%-й розчин сечовини; 6. 1,0%-й розчин фенолфталеїну; 7. 1,0%-й розчин йоду в йодиді калію.