2. Властивості амінокислот, методи їх кількісного визначення.
2.1. Визначення амінокислот методом тонкошарової хроматографії (тшх)/
Хроматографічний метод відносять до фізико–хімічних методів розділення та аналізу суміші, при якому компоненти даної суміші розподіляються між двома фазами – рухомою і нерухомою. Залежно від атомно-молекулярної взаємодії компонентів суміші з нерухомою фазою виділяють адсорбційну, іонообмінну, розподільну та гель-хроматографію. Хроматографічними методами можна розділити газоподібні та рідкі речовини будь-якої природи і в будь-якій кількості.
Найбільш поширеним є хроматографічне розділення в трубках, заповнених сорбентом (колоночна хроматографія), а також у тонкому шарі сорбенту (тонкошарова хроматографія). При тонкошаровій хроматографії використовують невеликі скляні пластинки, на які наносять тонкий шар сорбенту. Нерухома фаза формується за рахунок вологи (води), яка зв’язана з сорбентом; рухома – це один або кілька органічних розчинників. Швидкість руху компонентів суміші буде залежати від співвідношення між їх розчинністю у воді. Чим краща розчинність речовин у воді, тим більше вони будуть затримуватися вологою у сорбенті і тим повільнішим буде рух по пластинці.
Апаратура: сушильна шафа, фотоелектроколориметр, лабораторна центрифуга, годинник.
Лабораторний посуд: конічні колби місткістю 50 – 100 мл, хімічні стакани об’ємом 500 мл, хроматографічні пластинки, мікропіпетки.
Матеріали та реактиви: 1. Для проявлення хроматограм – 0,5%-й розчин нінгідрину в ацетоні оцтовокислому (0,5 г нінгідрину розчиняють у невеликій кількості ацетону у мірній колбі на 100 мл, далі додають 4 мл дистильованої води та 1 мл крижаної оцтової кислоти, перемішують, доводять до риски ацетоном); 2. Для елюювання плям – 0,005%-й розчин CuSO4 3H2O у 75%-му етанолі (0,005 г CuSO4 3H2O розчиняють у 21 мл дистильованої води, потім у колбу наливають 75 мл 96%-го етанолу); 3. Для закріплення забарвлення плям – 1,0%-й водний розчин NiSO4.
Принцип методу грунтується на розділенні суміші амінокислот між двома фазами – рухомою та нерухомою.
Хід роботи. Із наборів чистих амінокислот готують їх стандартні розчини – "свідки" концентрацією 1 мг в 1 мл. Для роботи використовують групи свідків, які мають різні значення Rf.
Розчинником служить 0,1 н. розчин соляної кислоти або вода з додаванням 10 %-го н-пропанолу. Для тривалого зберігання у пробірки додають по кілька кристалів HgCl2, розчини ставлять у холодильник.
Для досліджень студенти беруть приготовані лаборантом гідролізати, які мають різний вміст амінокислот.
На пластинці простим олівцем відмічають відстань 1,0–1,5 см від краю – це буде лінія старту A (рис. 1).
Рис. 1. Схема розділення суміші речовини на пластинці з тонким шаром сорбенту: А – лінія старту; Б – центр плями; В – лінія фронту розчинника; 1, 2 – “свідки”; х – суміш 1 і 2
Мікропіпеткою або мікрошприцем на лінію старту обережним доторканням наносять по 1–5 мкл проб гідролізатів та свідків на відстані 1 см один від одного. Діаметр нанесеної проби не повинен бути більшим за 2–3 мм. Чим менше діаметр проби, тим компактнішою буде пляма при розділенні. При цьому якщо за один раз пробу не нанесено на хроматограму, пляму підсушують, а потім знову наносять у те саме місце ще одну порцію розчину. Так повторюють до тих пір, поки не нанесуть всю пробу.
Проби можна наносити у вигляді крапок або смужок довжиною 6–7 мм.
Пластинку з підсушеними плямами проб вміщують у спеціальну посудину (хроматографічну камеру), в яку наливають невелику кількість розчинника (наприклад, н–бутанол, крижана оцтова кислота, вода у співвідношенні 4:1:1), якої має бути стільки, щоб пластинка занурювалася тільки на 0,5 см, аби не вимити нанесені проби. Пластинку розміщують у камері вертикально за допомогою підпірки або під невеликим кутом, спираючи її на стінку посудини. Зверху камеру накривають пришліфованою кришкою або склом.
Підняття розчинника по шару сорбенту не повинно перевищувати 10–11 см, тому що при більшому піднятті фронту розчинника буде спостерігатися сильне уповільнення просування розчину та дифузія плям, і як наслідок, великі коливання результатів.
Після того як розчинник досягне визначеного рівня, пластинку виймають і відмічають лінію фронту. Якщо суміш розганяють один раз, то пластинку можна проявляти відразу з наступним нагріванням у сушильний шафі. Якщо розганяють кілька разів, то пластинку висушують під тягою або злегка нагрівають на плитці із захованою спіраллю, а потім знову занурюють у розчинник. При цьому необхідно пам’ятати, що для того, щоб якісно розділити суміш, розчинник повинен кожного разу бути свіжим.
Після розділення суміші хроматограму обробляють 0,5%-ним розчином нінгідрину і трохи підсушують у витяжній шафі (2–3 хв.). Після цього хроматограму переносять до сушильної шафи для проявлення плям. Через 5–7 хв. при температурі 80–100°С інтенсивність забарвлення плям буде максимальною.
Проявлені хроматограми піддаються якісному аналізу: ідентифікують амінокислотний склад суміші та визначають Rf кожної амінокислоти.
Для цього позначають (як на рис. 1) положення плям дослідної суміші та “свідків”, які знаходяться між лініями старту та фронту розчинника. Далі вимірюють відстані від центру плями до лінії старту (АБ) та від лінії фронту розчинника до старту (АВ). Відношення відстані від лінії старту до центру плями (АБ) до відстані від лінії старту до фронту розчинника (АВ) позначають через коефіцієнт росподілення Rf (Rf = АБ/АВ). Коефіцієнт росподілення Rf характеризує положення амінокислоти на цій хроматограмі.
Величина Rf є характерною величиною для кожної амінокислоти і залежить від типу та активності сорбенту, товщини його шару, складу розчинника, температури.