2.2. Визначення азоту амінних груп методом формольного титрування

Методи кількісного визначення амінокислот досить різноманітні і чисельні. У деяких випадках необхідно визначити сумарну кількість усіх амінокислот у гідролізаті білків, або в екстрактах з біологічного матеріалу.

Один із таких методів, заснований на визначенні азоту амінних груп, був запропонований Сьоренсеном.

За зміною вмісту амінного азоту можна судити про швидкість гідролізу білка, дії протеолітичних ферментів, швидкість перетворення білків та амінокислот у тканинах організму.

Під час гідролізу білка внаслідок розриву пептидних зв'язків у розчині відбувається збільшення вільних аміно- і карбоксильних груп. Амінокислоти у водних розчинах утворюють внутрішньо молекулярні солі, тому без попереднього блокування аміногруп безпосередньо титрувати лугом карбоксильні групи неможливо.

Лабораторний посуд: колби конічні, бюретка для титрування.

Матеріали та реактиви: 1. 0,25%-й розчин гліцину або гідролізат білка; 2. 0,1%-спиртовий розчин фенолфталеїну; 3. 0,1 н. розчин гідроксиду натрію; 4. Формольна суміш (до 6 мл 20%-го розчину формальдегіду додають краплину фенолфталеїну і краплинами 0,1 н. розчин гідроксиду натрію до почервоніння рідини. Суміш готують перед початком роботи).

Принцип методу грунтується на здатності формальдегіду зв’язувати вільні аміногрупи з утворенням метиленових похідних амінокислот

Аміногрупи при цьому втрачають основні властивості, а вільні карбоксильні групи відтитровують розчином лугу

Існує кілька модифікацій методу формольного титрування, в основі яких лежать наведені реакції.

Хід роботи. У колбу на 25 мл наливають 3 мл 0,25%-го розчину амінокислот (наприклад, гліцину) або гідролізату білка; додають краплину 0,1%-го спиртового розчину фенолфталеїну і краплинами 0,1 н. розчин їдкого натру до почервоніння рідини. У нейтралізований таким чином гліцин доливають 2 мл формольної суміші. При цьому червоне забарвлення розчину зникає. Далі титрують 0,1 н. розчином гідроксиду натрію до появи червоного забарвлення.

Обчислення вмісту азоту амінних груп у досліджуваному матеріалі проводять таким чином: наприклад, на титрування дослідного розчину (3 мл 0,25%–го нейтралізованого розчину гліцину) витратили 0,98 мл 0,1 н. розчину гідроксиду натрію. Знаючи, що 1 мл 0,1 н. розчину гідроксиду натрію відповідає 1,4 мг азоту, обчислюємо кількість амінного азоту в дослідному розчині:

Дослідний розчин містить 7,510^–3 г амінокислоти (0,25% – це 0,25 г у 100 мл, ми взяли 3 мл). Якщо в 7,510^–3 г гліцину міститься 1,3710^–3 г, то в 100 г гліцину буде 18,2 г, або 18,2%. Аналогічно роблять розрахунок вмісту амінного азоту у гідролізаті білка.

3. Властивості білків, методи їх кількісного визначення.

3.1. Ізоелектрична точка білків.

У водному середовищі розчинні білки мають певний заряд. Величина і знак заряду залежать від кількості іонізованих груп амінокислот, що входять до складу даного білка.

Іонізація карбоксильних груп глутамінової та аспарагінової кислот надають білковій молекулі негативного заряду, а іонізація аміногруп лізину та аргініну – позитивного. Більшість білків мають негативний заряд, тобто є кислими білками.

При певному значенні рН середовища ступінь дисоціації карбоксильних та аміногруп урівнюється, і молекула білка стає електронейтральною. Таке значення рН розчину називається ізоелектричною точкою. Для кислих білків значення ізоелектричної точки лежить в області рН менше 7,0 в якій пригнічується дисоціація карбоксильних груп, а при рН більше 7,0 пригнічується дисоціація аміногруп..

Розчини білків в ізоелектричній точці нестійкі і легко випадають в осад.

Лабораторний посуд: пробірки, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. 0,1 н. розчин оцтової кислоти; 2. 0,01 н. розчин оцтової кислоти; 3. 0,5%-й розчин казеїну в 1 н. розчині оцтовокислого натрію.

Принцип методу. Визначення ізоелектричної точки білків грунтується на здатності білків під дією осаджувачів, що викликають дегідратацію білків, при значенні рН середовища, що відповідає їх ізоелектричній точці, легко осаджуватися.

Хід роботи. У вісім пробірок наливають по 1 мл розчину казеїну і додають у певних співвідношеннях розчини оцтової кислоти для утворення різної реакції середовища, згідно з таблицею:

Розчини, мл	Номер пробірки
	1	2	3	4	5	6	7	8
Розчин казеїну	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
0,01 н розчин CH3COOH	0,6	1,25						
0,1 н розчин CH3COOH			0,25	0,50	1,0	2,0	4,0	8,0
Вода	8,4	7,75	8,75	8,5	8,0	7,0	5,0	1,0
Значення рН	5,9	5,6	5,3	5,0	4,7	4,4	4,1	3,8

Пробірки витримують при кімнатній температурі протягом 30 хв. Визначають ізоелектричну точку казеїну за максимальним ступенем помутніння.